Przejdź do zawartości

Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Metody/Badanie jednego etapu replikacji (One-Step Growth) faga φOS10

Z Wikibooks, biblioteki wolnych podręczników.

Procedura zastosowana w niniejszej pracy bazowała na metodyce Kropińskiego [Kropiński, 2018] z pewnymi modyfikacjami (Podrozdział 4.19.3). Do badania wykorzystano szczep wrażliwy Serratia sp. OS10.

Nocną hodowlę OS10, pochodzącą z pojedynczej kolonii, odmładzano w płynnej pożywce LB w 3 wariantach, tj. w stosunkach objętościowych: 1:20, 1:50 oraz 1:100. Dla każdego z wariantów określano przybliżony czas, w jakim każda z odmładzanych hodowli osiąga OD 600 = 0,5 (z zastrzeżeniem, iż są to wartości orientacyjne, mogące się różnić w zależności od miana nocnej hodowli, które za każdym razem jest inne). Po określeniu czasu odmładzania hodowli do osiągnięcia OD 600 = 0,5 i uzyskaniu odmłodzonej hodowli o wspomnianej OD, wykonywano rzędy rozcieńczeń odmłodzonej hodowli w podłożu płynnym LB. Wykonywano posiew powierzchniowy rozcieńczeń 10 -4, 10 -5 i 10-6 na podłożu stałym LB – tak przygotowane szalki inkubowano przez noc w temperaturze 20 °C, liczono wyrosłe kolonie i określano miano odmłodzonej hodowli OS10 o OD 600 = 0,5.

W oparciu o schemat przedstawiony na Rycinie 14 wyliczano MOI dla kolby adsorpcyjnej.

Rycina 14. Schemat badania jednego etapu replikacji faga. [Kropiński 2018, zmienione].

Zgodnie z procedurą w kolbie adsorpcyjnej znalazło się 0,1 ml zawiesiny cząstek fagowych o mianie 107 PFU/ml, co było tożsame z ilością 106 PFU. Do kolby adsorpcyjnej przenoszono 9,9 ml odmłodzonej hodowli szczepu wrażliwego o OD 600 = 0,5. Po wcześniejszym określeniu miana komórek w hodowli o OD 600 = 0,5 i przemnożeniu tego miana przez objętość 9,9 ml uzyskiwano przewidywaną ilość jednostek tworzących kolonie, zaś dzieląc przez tą wartość ilość cząstek fagowych (106 PFU) uzysk uzyskiwano ilościowy stosunek infekcyjnych cząstek bakteriofagowych do infekowanych komórek gospodarza – czyli MOI. W oparciu o MOI stosowane w procedurze, wyznaczano jaki odsetek wśród wszystkich zainfekowanych komórek szczepu wrażliwego stanowią komórki zainfekowane tylko 1 cząstką infekcyjną. W tym celu stosowano metodę statystyczną opisaną w czasopiśmie naukowym The Journal of general physiology [Ellis & Delbrück, 1939]. Zaprezentowany w publikacji wzór (Rycina 15) określał dla dowolnej komórki bakteryjnej prawdopodobieństwo zainfekowania przez „n” cząstek infekcyjnych – gdzie „m” jest wartością MOI, zaś „e” jest liczbą Eulera.

Rycina 15. Prawdopodobieństwo infekcji 1 komórki „n” cząstkami wirusowymi [Wikipedia, na podstawie: Ellis & Delbrück, 1939].

W oparciu o powyższy wzór wyliczano, jaki odsetek bakterii nie został zainfekowany – co definiowało wyrażenie „P(0)”. Po odjęciu od wartości „1” odsetku niezainfekowanych bakterii otrzymywano łączny odsetek zainfekowanych bakterii (przynajmniej 1 cząstką wirusową) opisany wzorem „1-P(0)”. Następnie w oparciu o powyższy wzór obliczano odsetek komórek zainfekowanych przez dokładnie 1 cząstkę infekcyjną – wyrażony jako „P(1)”. W oparciu o tak uzyskane dane wykonywano rachunek według wzoru „( P(1) / [1P(0)] )* 100%”, który opisywał procentowy udział komórek bakteryjnych zainfekowanych przez dokładnie 1 cząstkę infekcyjną wśród wszystkich zainfekowanych komórek bakteryjnych dowolną ilością cząstek infekcyjnych większą od „0”. Im odsetek ten był bliższy 100%, tym z większą pewnością można było uznać ilość łysinek zaobserwowanych na szalkach za ilość cząstek infekcyjnych obecnych w preparacie (w czasie pomiaru).

Odmładzanie nocnej hodowli szczepu OS10 wykonywano w pożywce płynnej LB wzbogaconej o chlorek wapnia o końcowym stężeniu 2 mM, którego dodatek zwiększał wydajność adsorpcji cząstek fagowych do komórek szczepu Serratia sp. OS10. Po uzyskaniu OD 600 = 0,5 przenoszono 9,9 ml odmłodzonej hodowli do kolby adsorpcyjnej. Do kolby adsorpcyjnej dodawano 0,1 ml zawiesiny fagowej o mianie 107 PFU/ml, jednocześnie zaczynając mierzenie czasu. Mieszaninę inkubowano w wytrząsarce w temperaturze 20 °C. Po 5 minutach przenoszono 0,1 ml zawartości z kolby adsorpcyjnej do „kolby A” zawierającej 9,9 ml pożywki płynnej LB, której zawartość następnie inkubowano w temperaturze 20 °C z wytrząsaniem (kolba A stanowiła jednocześnie odmłodzenie hodowli oraz 100-krotne rozcieńczenie mieszaniny z kolby adsorpcyjnej). Po upływie 5 minut

pobierano z „kolby A” mieszaninę w ilości: (i) 1 ml do probówki opisanej literą „K” zawierającej 50 µl chloroformu[1]; (ii) 100 µl do probówki oznaczonej symbolem „A1” zawierającej 150 µl nocnej hodowli OS10 oraz po określeniu czasu latencji w następnych podejściach dodawano (iii) 1 ml do „kolby B” zawierającej 9,9 ml jałowej pożywki płynnej LB (co stanowi 10-krotne rozcieńczenie zawartości kolby A). Zawartość probówki opisanej literą „K” mieszano przez około 1 min, po czym przechowywano w lodzie – preparat ten stanowił układ odniesienia, obrazujący ilość niezaadsorbowanych cząstek fagowych. Zawartość kolby B wytrząsano równolegle z wytrząsaniem kolby A, a po kolejnych 5 minutach 1 ml zawartości z kolby B przenoszono do kolby C zawierającej 9 ml jałowej pożywki LB. Do probówki z oznaczeniem „A1” po wymieszaniu i 5-minutowej inkubacji dodawano 4 ml agaru półpłynnego, mieszano i rozprowadzano po agarze dolnym na szalce podpisanej numerem seryjnym „A1” zgodnie z procedurą opisaną w Podrozdziale 4.1. Odstępy między kolejnymi pomiarami następowały zależnie od potrzeb – wynosiły od 5 do 15 minut. Każdy z pomiarów miał swój indywidualny numer seryjny składający się z litery oznaczającej kolbę oraz liczby porządkowej dla danego momentu pomiarowego (przy czym pomiary dla kolb A, B i C wykonane w tym samym momencie od infekcji w kolbie adsorpcyjnej miały ten sam numer i różniły się tylko literą). W pierwszym podejściu określano: czy czas latencji jest krótszy od 60 minut; w związku z czym wszystkie 12 pomiarów odbywało się tylko dla kolby A i między każdymi dwoma był odstęp czasowy 5 minut. W następnym podejściu wykonywano 19 pomiarów (pomiary A1-A5 wykonywane co 10 minut, a pomiary A5-A19 wykonywane co 5 minut). Po określeniu czasu latencji wykonywano kolejne powtórzenie, tym razem w odstępach 15-minutowych dla pomiarów A1-A6 oraz w odstępach 5-minutowych dla pomiarów A6-A14 i B8-B20. Celem wprowadzenia do doświadczenia kolby B było określenie, czy faza plateau ustala się w obrębie 10-krotnego rozcieńczenia hodowli z zachowaniem policzalności łysinek na szalce (z kolby B), czy dopiero w obrębie 100-krotnego rozcieńczenia hodowli (z kolby C). Po ustaleniu czasu latencji, tj. czasu, po którym nastąpił wysyp nowych cząstek infekcyjnych z zainfekowanych komórek gospodarza, postanowiono, że w następnym podejściu do eksperymentu, na około 10 minut przed przewidywanym wysypem, zbierane będą z kolby B próbki po 100 µl równolegle z dotychczas zbieranymi pomiarami z kolby A – dzięki czemu określano, po jakim czasie kończył się pierwszy wysyp i zachodziła faza drugiego plateau. Czwarte i piąte podejście przewidywały wykorzystanie 3 kolb: kolby A, kolby B i kolby C, dla których wiadomo było zarówno: ile wynosi czas latencji oraz jaki jest czas, w którym dojdzie do drugiego plateau (Rycina 16).

Rycina 16. Wykres zależności miana faga w hodowli od czasu [Kropiński, 2018, zmienione].

Podczas projektowania wykresu w oparciu o ilość łysinek mnożono ilość tych łysinek przez współczynnik (1000 µl/X)*10Y, gdzie X to objętość nakroplenia (tu 10 µl) lub objętość próbki badanej w teście pełnoszalkowym (tu 100 µl), zaś Y to rząd wielkości rozcieńczenia próbki względem zawartości kolby A. Wykres przedstawiano w formie diagramu punktowego. W późniejszym wariancie procedury odpowiednikiem kolejnych kolb były kolejne 10-krotne rozcieńczenia dla każdej próbki z kolby A.


Przypisy

  1. Rolą chloroformu było zabicie wszystkich komórek bakteryjnych w próbce. Skutkowało to wyeliminowaniem centrów infekcyjnych, które pochodzą z bakteriofagów zaadsorbowanych do komórek. Ewentualne łysinki powstałe na szalce z kontrolą mogły pochodzić jedynie z niezaadsorbowanych cząstek infekcyjnych. Ponieważ jednak cząstki fagowe składane w zainfekowanych komórkach są infekcyjne jeszcze zanim nastąpi rozpad komórki, pomiary prób kontrolnych wykonywano tylko dla pierwszych 15 minut eksperymentu.


Tekst udostępniony jest na licencji Creative Commons Uznanie autorstwa-Na tych samych warunkach 3.0.
Dodatkowe informacje o autorach i źródle znajdują się na stronie dyskusji.