Mikrobiologia/Ściana komórkowa bakterii

Znaczenie ściany komórkowej

Ściana komórkowa jest strukturą, od której w znacznej mierze zależy kształt komórki. Ma ona formę woreczka, co odbija się w jej łacińskiej nazwie (łac. sacculus - woreczek). Można ją porównać do balonika, który przy odpowiednio dużym ciśnieniu staje się napięty. W tej analogii cytoplazma komórki odpowiada gazowi w baloniku. W odróżnieniu jednak od balonika, który jest całkowicie nieprzepuszczalny dla różnych substancji, przez ścianę komórkową mogą bez przeszkód przenikać substancje drobnocząsteczkowe - ich selekcja następuje dopiero dzięki obecności błony komórkowej. Generalnie można więc powiedzieć, że prawdziwe będzie stwierdzenie, iż ściana komórkowa pełni głównie funkcję mechaniczną, ograniczając objętość komórki bakteryjnej i chroniąc ją przed pęknięciem, gdy komórka znajdzie się w roztworze o niższym ciśnieniu osmotycznym, niż ciśnienie osmotyczne protoplastu.

Mimo że budowa ściany bakterii jest inna, niż w przypadku roślin, także u Procaryota można zaobserwować zjawisko plazmolizy, polegające na obkurczaniu się protoplastu podczas przebywania bakterii w środowisku hipertonicznym. Wypływ wody z komórki powoduje zmniejszenie objętości cytoplazmy i odstawanie błony komórkowej od ściany, przy czym komórka kurczy się tym bardziej, im większa jest różnica pomiędzy ciśnieniem osmotycznym cytoplazmy, a otaczającego komórkę środowiska. Jak widać, w tym miejscu analogia do balonika nieco zawodzi - ściana komórkowa jest wprawdzie strukturą elastyczną, ale tylko do pewnego stopnia, nie obkurcza się ona tak silnie, jak protoplast.

Struktura ściany komórkowej

Rzut oka

Peptydoglikany to, jak można się domyśleć na podstawie nazwy, związki chemiczne powstające w wyniku połączenia peptydów z cukrowcami. Z reguły mają one charakter polimerów. Peptydy mogą być krótkie lub dłuższe, przy czym, jeśli są długie, można mówić o proteoglikanach. Proteoglikany występują powszechnie na powierzchni komórek eukariotycznych, stanowiąc często receptory dla wirusów

Podobnie, jak można to zaobserwować w przypadku roślin, ściana komórkowa bakterii składa się z podstawowego szkieletu, w który "wplątane" są dodatkowe związki. Różnica w tym wypadku polega jednak na tym, że ów szkielet nie jest utworzony z celulozy, ale z mureiny, rodzaju peptydoglikanu. Mureina, w ogólnym zarysie, składa się z długich, nierozgałęzionych łańcuchów polisacharydowych, połączonych ze sobą za pomocą krótkich peptydów.

Łańcuchy polisacharydowe mają, w przypadku mureiny, zawsze taki sam skład chemiczny: można je rozpatrywać jako połączone liniowo cząsteczki N-acetyloglukozoaminy i kwasu N-acetylomuraminowego. Cechą charakterystyczną jest to, że cząsteczki tych cukrowców są ułożone na przemian, zatem cała struktura jest bardzo regularna. Dla zainteresowanych dodam, że wiązanie pomiędzy N-acetyloglukozoaminą a kwasem N-acetylomuraminowym to często występujące w przyrodzie wiązanie β-1,4-glikozydowe.

Nieco bardziej skomplikowana jest sprawa łańcuchów peptydowych, pozwalających na usieciowanie łańcuchów cukrowych. Mogą one mieć różny skład, ale dwie jego cechy są niezwykle istotne, o czym powiemy sobie nieco później. Pierwsza sprawa dotyczy tego, że w skład tych peptydów muszą wchodzić takie aminokwasy, które zawierają dwie reszty aminowe. Dlaczego? Otóż obecność dodatkowej reszty aminowej pozwala na utworzenie dodatkowego wiązania peptydowego. Znaczenie tego faktu jest takie, że krótkie peptydy, związane z resztami kwasu N-acetylomuraminowego, mogą łączyć się ze sobą, co w przypadku pojedynczej grupy aminowej byłoby niemożliwe. Posłużmy się jeszcze raz analogią. Łańcuchy polisacharydowe przyłączają peptydy, które można uznać za rączki, wyciągnięte w kierunku rączek innego łańcucha. W tym przypadku dodatkowe aminokwasy z dwiema resztami aminowymi pełnią funkcję dłoni, dzięki którym łańcuchy mogą się połączyć. Idąc w stronę nieco makabrycznego porównania, możemy powiedzieć, że po odcięciu dłoni niemożliwe będzie złapanie się łańcuchów za ręce. Wracając jednak do rzeczywistości, nadmienię jeszcze, że najczęściej spotykanymi aminokwasami z dwiema resztami aminowymi są: kwas mezo-diaminopimelinowy i L-lizyna.

Zwróć teraz uwagę, drogi Czytelniku, że aminokwasy, o których mówimy, mają wyraźnie zaznaczoną konfigurację przestrzenną - tutaj docieramy do drugiej sprawy związanej z charakterystyką ściany bakteryjnej. Każdy, kto spotkał się z biologią w stopniu wystarczającym do poznania bardzo ogólnej struktury białek, wie z pewnością, że dominują w nich aminokwasy w formie L. Tymczasem peptydy budujące ścianę bakterii zawierają także aminokwasy w formie D. Najczęściej spotykany jest kwas D-glutaminowy. Wydawać by się mogło, że jest to jedynie drobny szczegół, jednak nic bardziej mylnego. Chwila zastanowienia doprowadzi nas do wniosku, że ściana komórkowa, podobnie jak praktycznie wszystkie inne struktury komórkowe, powstaje przy udziale enzymów. W tym miejscu dochodzimy do sedna sprawy. Jeśli enzym, odpowiedzialny za wprowadzenie D-aminokwasu ma poprawnie zadziałać, musi oczywiście bezbłędnie go rozpoznać i odróżnić od formy L. Mówiąc inaczej, forma D powinna pasować do enzymu tak, jak prawa dłoń lub prawa stopa pasują do prawej rękawiczki lub prawego buta. Wprowadzając związek podobny do D-aminokwasu możemy "oszukać" enzym i zahamować syntezę ściany. Odkrycie takiego związku było jednym z największych biologicznych odkryć wszechczasów, ale o tym opowiemy w dalszej części niniejszego rozdziału. Teraz natomiast zagłębimy się jeszcze bardziej w budowę ścian komórkowych bakterii i zobaczymy, w jaki sposób od takiej stosunkowo prostej struktury zależą bardzo dla nas ważne zjawiska.

Bakterie gramdodatnie i gramujemne

W 1884 roku duński badacz, Christian Gram, zaobserwował, że preparaty mikroskopowe bakterii można wybarwić wypracowaną przez niego metodą w ten sposób, że niektóre komórki mają albo kolor fioletowy, albo różowy. Przez samego Grama nowo odkryta metoda barwienia była wykorzystywana do rozróżniania pneumokoków od Klebsiella pneumoniae.

Christian Gram, w połowie XIX wieku, nie mógł jeszcze wiedzieć nic na temat mechanizmu swojego barwienia, ale dzięki jego odkryciu można obecnie przydzielić wszystkie gatunki bakterii do jednej z dwu grup: bakterii gramdodatnich, barwiących się na granatowo, oraz bakterii gramujemnych, barwiących się na różowo. Zanim zobaczymy, dlaczego tak się dzieje, pozwolę sobie jeszcze na dokonanie pewnej dygresji, mającej wyjaśnić, dlaczego zajmujemy się takimi szczegółami jak kolory komórek bakteryjnych powstające w wyniku jakichś dziwnych manipulacji. Otóż, zwłaszcza, jeśli w chwili gdy to czytasz, jest zima, istnieje duże prawdopodobieństwo, iż gdzieś w szafce leży pudełko z antybiotykami. Weź, drogi Czytelniku, ulotkę dołączoną do opakowania antybiotyku i przeczytaj fragment, opisujący działanie leku. Z pewnością trafisz tam na określenie gramdodatni, gramujemny, a może nawet na obydwa. Christian Gram z pewnością nie przewidywał, że jego odkrycie może być tak ważne, że będzie miało tak szerokie zastosowanie i że nawet w przypadku leczenia ludzi okaże się mieć olbrzymie znaczenie. W rzeczywistości, barwienie metodą Grama jest jedną z pierwszych czynności, podejmowanych podczas identyfikacji danego mikroorganizmu.

Barwienie Grama - podstawy zjawiska

Bakterie wybarwione metodą Grama: Gronkowiec złocisty - bakteria gramdodatnia na fioletowo i Pałeczka okrężnicy - bakteria gramujemna na różowo

Żeby dobrze zrozumieć podstawy zjawiska, którego efektem jest zróżnicowane wybarwianie się bakterii, prześledźmy krok po kroku metodę barwienia. Przy podawaniu kolejnych kroków od razu dokonywane będą objaśnienia, pozwalające zrozumieć sens takiego, a nie innego postępowania.

• Odtłuszczamy szkiełko podstawowe

Odtłuszczenie jest niezbędne, gdyż proces barwienia polega na dodawaniu kolejnych roztworów, które powinny równomiernie pokrywać powierzchnię szkiełka podstawowego. Ten etap, podobnie jak dwa następne, występuje przy wykonywaniu prawie każdego preparatu mikrobiologicznego (chyba, że będziemy prowadzić obserwacje przyżyciowe)

• Na odtłuszczonym szkiełku wykonujemy rozmaz bakterii, posługując się ezą i płynem fizjologicznym. Rozmaz należy wysuszyć!!!
• Przy użyciu specjalnych szczypiec przeciągamy preparat trzykrotnie nad płomieniem.

Ten etap ma dwojakie znaczenie. Po pierwsze, bakterie są zabijane - może mieć to pewne znaczenie przy przygotowywaniu preparatów z gatunków patogennych, gdyż powoduje zwiększenie bezpieczeństwa pracy. Po drugie (i to jest zasadniczy cel tego zabiegu), przeciąganie szkiełka nad płomieniem powoduje, że bakterie bardzo silnie do niego przylegają, co zapobiegnie ich zmyciu z powierzchni szkiełka w trakcie kolejnych etapów barwienia. Dlatego mówimy tutaj o utrwaleniu preparatu.

• Utrwalony preparat zalewamy fioletem krystalicznym na 60 sekund

Fiolet krystaliczny jest barwnikiem, który wybarwia wszystkie komórki, zarówno gramujemne, jak i gramdodatnie, na fioletowy kolor. Tak więc gdybyśmy mieli jedynie uwidocznić bakterie, barwienie w zasadzie można by było zakończyć na tym etapie. Jednak ze względu na fakt, że nie odróżnimy w ten sposób komórek gramdodatnich od gramujemnych, nie jest to dla nas rozwiązanie satysfakcjonujące

• Po delikatnym spłukaniu barwnika, preparat należy zalać płynem Lugola na 30 sekund

Płyn Lugola to tzw. bejca, czyli specjalny preparat, mający za zadanie utrwalenie wiązania barwnika. W przypadku fioletu krystalicznego po zastosowaniu płynu Lugola tworzą się kompleksy barwnika, w skład których wchodzi jod. Powoduje to oczywiście, że poszczególne cząsteczki różnych związków chemicznych, wchodzące w skład fioletu krystalicznego, zbijają się w agregaty o stosunkowo dużych wymiarach

• Preparat przez 30 sekund odbarwia się w etanolu

Ten etap ma decydujące znaczenie, powoduje on bowiem, że kompleksy barwnika są wypłukiwane z komórek. Jeśli w ścianie komórkowej występują wystarczająco duże pory, barwnik zostaje wypłukany, jednak gdy ściana komórkowa nie jest tak "dziurawa", barwnik pozostaje we wnętrzu komórki. W przypadku komórek gramujemnych, ściana komórkowa złożona jest z jednej warstwy mureiny i barwnik może swobodnie wydostać się z komórki. Jednak w przypadku bakterii gramdodatnich ściana komórkowa ma kilkadziesiąt warstw. Można to wyobrazić sobie jako kilkadziesiąt nałożonych na siebie siatek. Mimo że oka każdej siatki są wystarczająco duże, aby kompleks barwnika mógł wypłynąć z komórki, to po nałożeniu na siebie kilkudziesięciu takich siatek, barwnik nie może już zostać wypłukany. Ponadto etanol powoduje odwodnienie ściany komórkowej, czemu towarzyszy zaciskanie się poszczególnych warstw mureiny i zmniejszanie oczek sieci.

• Po odbarwieniu preparat jest płukany wodą i dobarwiany jakimś uniwersalnym barwnikiem, np. safraniną lub fuksyną

Safranina i fuksyna mają inną barwę niż fiolet krystaliczny. Ponieważ w wyniku płukania komórki gramujemne stają się bezbarwne, a gramdodatnie są fioletowe, dodatkowe barwienie pozwoli na wyraźne zróżnicowanie barwy komórek gramdodatnich i gramujemnych

• Preparat oczywiście oglądamy pod mikroskopem z zastosowaniem zjawiska immersji, co pozwala nie tylko na identyfikację zabarwienia ściany komórkowej, ale także na określenie kształtu badanych komórek.

Powyższy opis tłumaczy, dlaczego kolor komórek gramdodatnich i gramujemnych jest różny w wyniku przeprowadzenia tych samych etapów barwienia - mamy po prostu do czynienia z różnicami w budowie ściany komórkowej (szerzej są one opisane dalej). Musimy jednak zdawać sobie sprawę z faktu, że różnice w budowie bakterii gramdodatnich i gramujemnych to nie tylko różna budowa ściany komórkowej, ale także poważne, o medycznym znaczeniu, różnice w fizjologii tych bakterii.

Z kronikarskiego obowiązku należy także wspomnieć o gatunkach gramchwiejnych, czyli takich, które nie barwią się gramdodatnio lub gramujemnie, lecz są "niezdecydowane". Gramchwiejność może być także przejściowym etapem podczas wzrostu komórki bakteryjnej: jeśli bakterie gramdodatnie rosną szybko (tzn. często się dzielą), komórki potomne mogą nie nadążać z syntezą wielu warstw mureiny - będą więc barwić się jak bakterie gramujemne. Hodowle stare także barwią się na różowo, ponieważ są "braki" w ścianie komórkowej. Gramzmienność ma także odniesienie do promieniowców np. Nocardia coralis.

Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich

Bakterie gramdodatnie mają, jak już wspomniano, wielowarstwową ścianę komórkową. Wszystkich warstw jest zwykle ok. 40 i są one ze sobą połączone poprzecznymi wiązaniami. Grubość takiej ściany komórkowej wynosi 20-80 nm. Mureina stanowi od 40% do nawet 90% suchej masy ściany komórkowej. Jednak oprócz mureiny w ścianie komórkowej bakterii gramdodatnich znajdują się także inne związki chemiczne.

Najważniejsze z nich to kwasy tejchojowe, będące polimerami glicerolu i rybitolu, czasami również erytrytolu oraz mannitolu, przy czym poszczególne monomery są połączone wiązaniami fosfodiestrowymi. Ze względu na duże ilości fosforu zgromadzonego w kwasach tejchojowych, brak tego pierwiastka nie pozwala na syntezę tych związków. Wytwarzane są wtedy kwasy tejchuronowe, złożone z utlenionych form cukrów. Niektóre gatunki bakterii nie potrafią wytwarzać obu rodzajów kwasów: produkowane są wtedy albo kwasy tejchojowe, albo tejchuronowe. Kwasy tejchojowe i tejchuronowe przechodzą w poprzek ściany komórkowej - są "wplecione" w mureinę. Podobnie rozmieszczone są kwasy lipotejchojowe, zawierają one jednak dodatkowy komponent tłuszczowy, który zakotwicza je w błonie komórkowej bakterii.

Mimo że kwasy tejchojowe stanowią nawet do 50% suchej masy ściany komórkowej bakterii gramdodatnich, bardzo ważną rolę pełnią polisacharydy oraz białka w niej zawarte. Jest to szczególnie istotne w przypadku bakterii chorobotwórczych, gdyż zarówno białka, jak i powierzchniowe cukry, są silnymi antygenami. Dlatego zmienność ich struktury odpowiada za zmienność serotypową bakterii gramdodatnich. Białka znajdują się głównie na zewnętrznej powierzchni ściany komórkowej bakterii gramdodatnich i mogą pełnić funkcję adhezyn (pozwalając na przyleganie komórki do podłoża lub komórek gospodarza), enzymów i inwazyn (dając bakterii zdolność do wnikania do komórki gospodarza) oraz mogą chronić bakterie przed zlizowaniem przez dopełniacz. Jak widać, funkcje te są w zasadniczy sposób związane z chorobotwórczymi właściwościami danego szczepu bakteryjnego.

Należy także zaznaczyć, że sama mureina różni się w składzie chemicznym pomiędzy bakteriami gramdodatnimi i gramujemnymi. W przypadku bakterii gramdodatnich charakterystyczne jest występowanie w mureinie kwasu LL-diaminopimelinowego lub L-lizyny, nie występuje natomiast kwas mezo-diaminopimelinowy.

Ściana komórkowa bakterii gramujemnych

Ściana komórkowa bakterii gramujemnych zbudowana jest z pojedynczej warstwy mureiny, której towarzyszą dodatkowe związki chemiczne. Istnieją jednak dowody na to, że ściana bakterii gramujemnych może być zbudowana także z 2-3 warstw peptydoglikanu, w którym występuje kwas mezo-diaminopimelinowy i nie występuje lizyna. Skład chemiczny peptydoglikanu może znacznie różnić się od analogicznej struktury u bakterii gramdodatnich - obecnie przyjmuje się, że jedynie u 10-30% bakterii gramujemnych w skład ściany komórkowej wchodzi peptydoglikan o podobnym charakterze chemicznym, co u bakterii gramdodatnich. Niezależnie jednak od tych różnic, grubość ściany wynosi 2-10 nm i nie stwierdza się w niej obecności kwasów tejchojowych. Peptydoglikan "zanurzony" jest w przestrzeni peryplazmatycznej, w której występują także enzymy: rozkładające antybiotyki - beta-laktamaza, enzymy transportujące substancje odżywcze do i z komórki.

Budowa ściany komórkowej bakterii gramujemnych nie jest skomplikowana, gdyż, w odróżnieniu od bakterii gramdodatnich, struktura ta nie kontaktuje się z otoczeniem. Okazuje się bowiem, że w przypadku bakterii gramujemnych ściana komórkowa jest otoczona dodatkową błoną, tzw. błoną zewnętrzną (szerzej zostanie ona przedstawiona dalej). Zatem praktycznie jedyną funkcją ściany komórek gramujemnych jest zapobieganie cytolizie wywołanej zmianami ciśnienia osmotycznego.

Pytania

1. Łańcuchy polisacharydowe w mureinie są polimerami. Czy możesz powiedzieć, jaki w tym przypadku jest monomer budujący te łańcuchy?
2. Barwienie Grama. Skoro już w wyniku odbarwiania etanolem komórki bakteryjne są zróżnicowane pod względem gramdodatności/gramujemności, to po co jeszcze stosuje się dobarwianie komórek safraniną lub fuksyną?

ODP: Ponieważ po odbarwieniu etanolem bakterie gram ujemne pozostają niezabarwione (będą słabo widoczne).