Mikrobiologia/Posiew

Posiew jest podstawową metodą diagnostyki bakteriologicznej i mikologicznej zarówno w mikrobiologii klinicznej, jak i "badawczej". Najkrócej rzecz ujmując posiew to metoda uzyskania pojedynczych, odosobnionych kolonii bakterii, czy grzybów na podłożach mikrobiologicznych. Metod i sposobów uzyskania tego jest wiele - lecz jedynie kilka jest powszechnie używanych. My przedstawimy 6, dość popularnych metod, którym dla ułatwienia nadamy

Rzut oka

Eza, najkrócej rzecz ujmując, to igła preparacyjna zakończona metalową pętelką. (opis w Wikipedii)

nieformalne numery. Metody I-III są metodami "jakościowymi", zaś kolejne dwie pozwalają dość precyzyjnie określić ilość drobnoustrojów w analizowanym materiale. Szósta - ostatnia to metoda, powiedzmy, pomocnicza. Narzędziem obecnie używanym do posiewu są głównie ezy, do niedawna stosowało się także wygięte w kilku miejscach szklane bagietki. Do posiewów, aby uzyskać wiarygodne wyniki, używamy sterylnego sprzętu, a ezy nie powinny być gorące.

Metoda I

"Metoda I" nazywana jest czasem metodą uproszczoną. Metody tej można używać tylko przy wysiewaniu na podłoża stałe.
Główną zaletą tej metody jest jej prostota. Posiew wykonuje się "rysując" ezą wgłębienia w podłożu tak, jak pokazano na poniższym rysunku. Używa się jej głównie przy hodowlach z materiału zawierającego niewiele bakterii (np. z moczu).

Schemat posiewu "metodą pierwszą"
Kierunek prowadzenia rozmazu.	Przykładowy wygląd hodowli.

Metoda II

Kolonie laseczek wąglika (Bacillus anthracis) z materiału posianego redukcyjnie.

Metoda ta jest powszechnie znana, jako posiew redukcyjny. Jej twórcą jest niemiecki mikrobiolog Robert Koch. Metody tej można używać tylko podczas wysiewania na podłoża stałe.

Posiew redukcyjny jest najpopularniejszą metodą posiewu, na co wpływa jego uniwersalność względem ilości mikroorganizmów w wyjściowej zawiesinie. Istnieje kilka możliwości poprawnego wysiania materiału metodą redukcyjną, nieznacznie różniących się między sobą. My zaproponujemy chyba najprostszą z nich. Sam proces posiewania podzielić można na cztery części. Wygodnie byłoby, szczególnie przy dużej liczbie posiewów, zaopatrzyć się w cztery kolejno ułożone w stojaku (aby nie mieszało się, które są "gorące", a które nie) ezy - po jednej do każdego etapu. Po pobraniu materiału wcześniej wysterylizowaną w płomieniu palnika ezą należy rozprowadzić go po podłożu do około 40% szerokości szalki Petriego w identyczny sposób, jak w przypadku "metody pierwszej" (etap 1). Następnie sterylizujemy użytą ezę, dla wygody obracamy płytkę o 90° i kolejną z rzędu pętlą bakteriologiczną powtarzamy czynność (etap 2). Obracamy znów płytkę Petriego (trzymając się obranego kierunku) i powtarzamy czynności (etap 3). W etapie 4 kolejną ezą poruszamy w taki sposób, aby zmieścić się w górnej części etapu trzeciego i wolnej przestrzeni pośrodku. W tym momencie posiew został zakończony, płytkę możemy włożyć do cieplarki. Sami za to możemy wziąć pierwszą ezę i zacząć wszystko od początku...

Schemat posiewu redukcyjnego
etap 1	etap 2	etap 3	etap 4

Metoda III

Typy podłoży bakteriologicznych w probówkach; 1, 2 - pożywka skośna

Wzrost grzyba Histoplasma capsulatum (będącego przyczyną zakażeń ukł. oddechowego) na dwóch podłożach: Sabouraud (L) i Sabhi (P).

Paragraf ten opisuje metody wysiewania na podłoża stałe wylane do probówek. Jest dość dużo możliwości w jakich podłoże (np. agar) może zastygnąć (patrz rysunek).
Z racji braku miejsca na wszystkie manewry niezbędne do wykonania posiewu musimy używać innego, pozbawionego oczka ("pętelki"), typu ezy: tzw. ezy kłutej. Posiew wykonujemy w sposób zbliżony do "metody I".

Jest to metoda dość prosta i, mimo tego, rzadko używana w celu hodowli bakterii. Może być wykorzystywana do prób identyfikacji szczepów na podstawie wyników ich wzrostu na różnego typu podłożach. Niemniej jednak, biochemiczne testy odbywające nieomal bez udziału laboranta są powszechniejsze. Nasza "trzecia metoda", choć wiekowa, dostarczyć może wielu informacji (np. o zdolności do ruchu), których nie można bezpośrednio wywnioskować po automatycznych testach.

Test na zdolność dekarboksylazy lizyny (reakcja charakterystyczna dla rodzaju Salmonella - właściwie bez gatunku S. typhi /ok. 10% wyników dodatnich/): pierwsze 3 dodatnie, 4 ujemny.

Na pożywkach wylanych skośnie bardzo wygodnie hoduje się grzyby - organizmy rosnące zarówno nad, jak i pod powierzchnią pożywki. Nierzadko nie wysiewa się grzybów przyrządami mikrobiologicznymi, lecz po prostu wrzuca do probówki materiał (np. fragmenty paznokcia).

Metoda IV

Metoda czwarta, zwana techniką seryjnych (wielokrotnych) rozcieńczeń, została opracowana w 1878 roku przez angielskiego chirurga, twórcę antyseptyki barona Józefa Listera.
Pozwala ona bardzo dokładnie określić ilość bakterii w wyjściowej zawiesinie. Podstawą metod ilościowych jest prawo mówiące, że z jednej bakterii w roztworze wyjściowym powstaje na drodze podziałów jedna kolonia. Jest metodą wymagającą kilku probówek i przynajmniej 2 płytek z odpowiednim podłożem. Przygotowując materiał do wysiania rozcieńczamy go kilkukrotnie w stosunku 1:10 tak, jak pokazano na rysunku. Zazwyczaj dokonuje się sześciu, siedmiu rozcieńczeń. Następnie pipetą mikrobiologiczną do jałowych końcówek pobiera się materiał z kilku (dwóch, trzech) ostatnich probówek. Następnie pobrany materiał, o określonej objętości rozsiewa się redukcyjnie - "metodą drugą" (oczywiście materiał z każdej końcówki na innej szalce Petriego).

Metoda wielokrotnych rozcieńczeń Listera:
wszystkie wykładniki potęgowe są ujemne, x wynosi zazwyczaj od 5 do 10.

Równie prosto można policzyć ilość mikroorganizmów (z wyhodowanej grupy) w danej jednostce objętości (identycznej z wysianą objętością) wewedług wzoru:

${{a} \over {b}}\cdot (10^{-x})^{-1}$, gdzie

a - liczba kolonii
b - objętość posiania
10^-x - współczynnik rozcieńczenia
W przypadku potrzeby porównania wyników z hodowli, w których pod uwagę brano różne objętości materiału warto skorzystać z (jakże popularnych wśród chemików) proporcji.

Metoda V

Powyższa metoda, choć uniwersalna, jest jednak w stanie (delikatnie mówiąc) dać się we znaki. Nie jest na pewno najszybsza, wymaga wielu operacji, wielu płytek... Czasem, gdy do policzenia mamy niewielką ilości bakterii nie ma sensu korzystać z tego mikrobiologicznego arsenału możliwości. W takiej sytuacji wygodna jest metoda Hoepricha. Do przeprowadzenia hodowli wykorzystując tę metodę będzie potrzebne po 1 płytce Petriego z każdym interesującym nas podłożem, a także eza, o ściśle określonej średnicy oczka - tzw. eza kalibrowana. Metody tej używać można jedynie do wysiewania materiału płynnego. Sterylną ezą kalibrowaną należy pobrać materiał (tak, aby oczko było "pełne"), a następnie rozsiać go metodą pierwszą lub drugą. Przy posiewie redukcyjnym ezy kalibrowanej należy użyć podczas umownego "etapu 1.". W dalszych "etapach", dla wygody, używać możemy zwykłych ez.
Interpretacja wyników jest zależna od średnicy oczka ezy kalibrowanej - zazwyczaj wystarczy pomnożyć ilość kolonii przez 100 lub 1000, aby uzyskać ilość bakterii w 1 mm³ materiału.

Metoda VI

Jako metodę VI (ostatnią) proponujemy technikę wysiewania na podłoża płynne. Metoda ta ma znaczenie pomocnicze - głównie, gdy chcemy uzyskać zawiesinę bakterii z materiału stałego. Możemy to ciało stałe zalać pożywką płynną, a także do pożywki wprowadzić materiał z ezy, czy wacika do wymazów kilkukrotne wkładając i wyjmując narzędzie (najlepiej dotykając przy tym ścianek naczynia). Następnie możemy:

• zawiesinę inkubować (wygodne, gdy nie prowadzimy badań ilościowych lub gdy dane ilościowe służą wyłącznie do porównań) po czym wysiać jedną z powyższych metod na płytki Petriego;
• bezpośrednio po zabiegu wysiać jedną z powyższych metod na płytki Petriego.

Pytania

Kolonie Corynebacterium pseudotuberculosis

1.Na ilustracji obok przedstawione są kolonie po posiewie redukcyjnym. W którym miejscu rozpoczęto posiew, a w którym zakończono?
2. Badając fizjologiczną mikroflorę układu moczowego i jelit człowieka poprzez analizę odpowiednio moczu i kału do określenia liczebności mikrobów wykorzystano metodę Hoepricha. Gdzie naukowcy popełnili błąd (o ile popełnili)?

Odpowiedzi