Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Wyniki i dyskusja/Analiza bioinformatyczna/Analiza genomu bakteriofaga φOS10

5.3.1 Analiza genomu bakteriofaga φOS10

 Genom φOS10 miał długość 45 027 nt – wielkość ta jest typowa dla przedstawicieli rzędu Caudovirales, jednak wśród innych dotychczas zsekwencjonowanych bakteriofagów infekujących bakterie z rodzaju Serratia jest to długość stosunkowo niewielka: genomy zsekwencjonowanych bakteriofagów Serratia osiągają długości od 39 216 bp (bakteriofag 2050H2, Gene Bank MF285620.1) do 357 154 bp (bakteriofag BF, Gene Bank NC_041917.1), gdzie średnia długość genomu wynosiła 139 444 bp, a mediana 158 616 bp. Zestawienie wszystkich genomów bakteriofagów przedstawiono w Podrozdziale 1.7. Udział poszczególnych zasad azotowych w nici wiodącej zsekwencjonowanego genomu φOS10 przedstawiono w Tabeli 9.

Tabela 9. Zestawienie ilościowe udziału zasad azotowych w genomie φOS10 oraz zawartość par CG.

Zasada	Zawartość [%]	Ilość [nt]
A	23,87%	10750
T	24,52%	11040
G	24,58%	11068
C	27,03%	12169
% GC	51,61%

Zawartość par GC jest mniejsza niż w przypadku genomów bakterii z rodzaju Serratia, które do tej pory zsekwencjonowano np. w szczepie Serratia marcescens subsp. marcescens Db11 wynosi 59,5% [Iguchi i in., 2014]; w szczepie Serratia liquefaciens ATCC 27592 wynosi 55,3% [Nicholson i in., 2013]; zaś w szczepie Serratia proteamaculans 568 wynosi 54,9% [Grkovic i in., 1995]. Sekwencję genomu φOS10 przyrównano z użyciem narzędzia BLAST N do sekwencji genomów innych bakteriofagów infekujących Serratia. Wykryto podobieństwo sekwencji nukleotydowej bakteriofaga φOS10 jedynie do dwóch spośród 20 poznanych i zsekwencjonowanych wcześniej fagów Serratia (Rycina 18):

• do bakteriofaga Parlo (Gene Bank MK618715.1) w dwóch segmentach (o długości 381 nt, gdzie e = 2 * 10 - 133; oraz o długości 42 nt, gdzie e = 1 * 10 - 12), co stanowi w sumie 0,67% długości genomu bakteriofaga Parlo;
• do bakteriofaga η (Gene Bank NC_021563.1) w czterech segmentach (o długości 96 nt, gdzie e = 2 * 10 ^{- 33}; o długości 98 nt, gdzie e = 2 * 10 ^{- 27}; o długości 35 nt, gdzie e = 3 * 10 ^{- 11} i o długości 32 nt, gdzie e = 1 * 10 ^{- 9}), co stanowi w sumie 0,61% długości genomu bakteriofaga η.

> Eta_1 NC_021563.1 (13351-13446) caccgagctgcgggaggccaaatgaaagagcgcccagtgattttcaacggtgagatggttcgcgccatcctcgac ggacgcaagacgcagacacgc > Eta_2 NC_021563.1 (13942-14039) tccatttacggggaagaaagctggagcgctaatccctgggtatgggtgatcgagtttcgtcgtgtgggaggtgcg tgatgccagcaaatgaactgaag > Eta_3 NC_021563.1 (13035-13069) tgaaggctgagcgcgatgcgctggctgtggagaat > Eta_4 NC_021563.1 (15953-15984) ggcttcaccgtagagggggatgagtagatggc > Parlo_1 MK618715.1 (16408-16788) ggctaaccgggaggcgcagccggtgtatcaatgccgcttcttcactaccgatattgacggaaaacaaatcggtga gtggcaggatatggataaagggttctatgaccaatacgacccacactgccgccgcgttttgttcaccgccccgcc tgcgctaggagtgccggatggggttatgccaggcggtctaggctactcatcagcgctacctgagtttgaaagcaa cgacagcgataaggttgttggatatcactgctttatcagcggtcaaactcgaagcgtggaaagccaagagcaggc gtatgccgacgccaaggctgtaattaacgcctaccgcgccgcaatgctggctcaacccgtaagccagggttacaa gttacc > Parlo_2 MK618715.1 (15944-15984) cgcgccgctggcttcaccgtagagggggatgagtagatggc

Rycina 18 Sekwencje nukleotydowe segmentów genomu φOS10 wykazujące podobieństwo do genomów bakteriofagów η i Parlo.

Sekwencje przedstawione na Rycinie 18 zbadano z użyciem narzędzia BLAST X, w wyniku czego udało się zadnotować jedynie sekwencje:

• Parlo_1, którą dopasowano do hipotetycznego białka bakteriofaga Parlo (e = 2 * 10 ^{- 77}) (Gene Bank QBQ72186.1);
• Eta_1, którą dopasowano do hipotetycznego białka S. marcescens (e = 8 * 10 ^{- 11}) (Gene Bank TQI84827.1);
• Eta_2, którą dopasowano do białka „restriction alleviation protein” z rodziny białek Lar, należącego do S. marcescens (e = 1 * 10 ^{- 8}) (Gene Bank WP_080431124.1). Białko to odpowiedzialne jest za modulację systemów restrykcji i modyfikacji [King & Murray, 1995].

 We względu na niskie wartości pokrycia (0,67% dla bakteriofaga Parlo i 0,61% dla bakteriofaga η) nie można uznać tych bakteriofagów za spokrewnione z bakteriofagiem φOS10 – podobieństwo tych sekwencji jest najprawdopodobniej przypadkowe lub spowodowane nabyciem ich na drodze zdarzeń rekombinacyjnych. Powyższe wyniki wykluczają jakiekolwiek istotne podobieństwo genomu bakteriofaga φOS10 do innych dotychczasowo zsekwencjonowanych bakteriofagów Serratia oraz jakichkolwiek innych zsekwencjonowanych bakteriofagów, w związku z czym jest on unikatowy i stanowi ważny wkład w wiedzę o bakteriofagach Serratia. Genom φOS10 przeanalizowano z użyciem programu ARAGORN [Laslett i in., 2004] pod kątem obecności genów kodujących tRNA (Podrozdział 4.17.5), nie znaleziono w genomie sekwencji kodujących tRNA.
 W genomie φOS10 zidentyfikowano 71 otwartych ramek odczytu (ORF) o wielkości co najmniej 50 nt. Najmniejszy z nich (ORF 14) ma długość 122 nt, a największy (ORF 45) ma długość 2381 nt. Średnia długość ORF wynosi około 583 nt. Zidentyfikowane ORFy stanowią 91,86% zsekwencjonowanego genomu. ORFy zawarte są zarówno na nici wiodącej i nici komplementarnej, z czego 43 ORFy znajdują się na nici wiodącej, a 28 ORFów znajduje się na nici komplementarnej. Adnotację genomu φOS10 wykonywano z wykorzystaniem programu Artemis, w którym możliwa jest wizualizacja ORFów (Rycina 19). Każdej ORF nadano numery porządkowe od 1 do 71.

Rycina 19. Analiza bioinformatyczna z użyciem programu Artemis.

 Dla każdej ORF zaznaczonej w sekwencji nukleotydowej wygenerowano z pomocą programu Artemis sekwencje białek przez nie kodowanych, dla których następnie z użyciem programu BLAST P wyszukiwano w bazach UniProt oraz NCBI rekordów o największym pokryciu, największej identyczności sekwencji oraz najmniejszej „E-wartości” (Podrozdziały 1.6.3 i 4.17). Wyniki adnotacji zestawiono w Tabeli 10. Domniemany produkt białkowy jednej ze zidentyfikowanych ORF został zaadnotowany jako integraza, co stanowiło następną przesłankę do postawienia hipotezy, że bakteriofag φOS10 jest łagodny (pierwszą były mętne łysinki, Podrozdział 5.1). Innymi przypuszczalnymi produktami białkowymi ORFów były między innymi białko portalowe (ORF 68) i terminaza (ORF 70). Nie udało się dopasować do białek o znanych funkcjach domniemanych produktów białkowych 19 ORFów spośród 71 zidentyfikowanych (co stanowi około 27%). Rezultat ten jest satysfakcjonujący zważywszy na fakt, że w innych przypadkach odsetek ORFów o niezidentyfikowanej funkcji może wynosić 33% [Dziewit i in., 2014] lub nawet 60% [Santos i in., 2011]. Przy przewidywaniu funkcji białek fagowych bardzo pomocna jest lokalizacja kodujących je ORFów, gdyż genomy wirusów mają budowę modułową, jak wspomniano w podrozdziale. 1.3. W związku z tym położenie ORFu o nieznanej funkcji, w otoczeniu ORFów, którym przypisuje się określone funkcje, jest wskazówką co do prawdopodobnej funkcji jej produktu białkowego. Należy podkreślić, że funkcje przypisane produktom zidentyfikowanych ORFów są tylko przypuszczalne, potwierdzenie tych funkcji wymaga testów eksperymentalnych. Obok przeszukania programem BLAST P jeszcze innym sposobem przewidywania funkcji białek jest dopasowanie ich sekwencji aminokwasowych do sekwencji domen białek, których funkcje określono eksperymentalnie. W niniejszej pracy wykorzystano do tego celu program HMMER (Podrozdział 1.6.4).

Tabela 10. Zestawienie wyników adnotacji ORFów faga φOS10. Nazwy wszystkich domniemanych funkcji białek zapisano w języku angielskim, ze względu na brak polskich odpowiedników dla nazw niektórych białek.

ORF	Region kodujący (bp)	Orientacja	Wielkość białka (aa)	Prawdopodobna funkcja (motywy i domeny)	Największe podobieństwo (program BLAST P)
					Procent identyczności (aminkwasyaminokwasy§) (koordynaty motywu)	e-value	Organizm	Numer w GenBank (numer pfam) (numer EC) (numer supfam)
1	77-301	←	74	hypothetical protein	38/68(56%)	3 * 10-18	Serratia marcescens	WP_072264995.1
2	280-525	←	81	hypothetical protein (Protein of unknown function)	61/81(75%)	4 * 10-33	Serratia marcescens	WP_118892208.1 (PF11684.8)
3	550-1194	←	214	minor tail protein (coiled-coil motive)	67/212(32%)	7 * 10-28	Rhodobacter phage RcSaxon	AKY02713.1
4	1236-1376	←	46	DEAD/DEAH box helicase (Zinc finger, C2H2 type)	14/31(45%)	3 * 10-10	Roseomonas stagni	WP_092963283.1 (PF00096.26)
5	1373-1627	←	84	DNA polymerase III subunit theta (DNA polymerase III, theta subunit)	82/84(98%)	8 * 10-62	Serratia proteamaculans	WP_115059749.1 (PF06440.11)
6	2037-2561	←	174	DUF2570 domain-containing protein (Phage shock protein B)	123/166(74%)	7 * 10-93	Serratia sp. YD25	WP_063919321.1 (PF06667.12)
7	2558-3088	←	176	putative lysis protein (Phage lysozyme)	136/175(78%)	2 * 10-107	Pectobacterium phage ZF40	YP_007006943.1 (PF00959.19)
8	3090-3386	←	98	phage 21-like group II holin (Bacteriophage holin family HP1)	15/50(30%)	1 * 10-06	Bacteriophage APSE-7	WP_016857351.1 (PF16080.5)
9	3554-3928	←	124	hypothetical protein (RcsF lipoprotein)	117/124(94%)	4 * 10-91	Serratia proteamaculans	WP_115058997.1 (PF16358.5)
10	4225-4929	←	234	antitermination protein (Antitermination protein)	218/234(93%)	3 * 10-169	Serratia proteamaculans	WP_115059758.1 (PF03589.13)
11	4926-5282	←	118	RusA family crossover junction endodeoxyribonuclease (Endodeoxyribonuclease RusA)	117/118(99%)	8 * 10-90	Serratia marcescens	WP_060431945.1 (PF05866.11)
12	5279-6253	←	324	DUF968 domain-containing protein (Protein of unknown function DUF968)	318/324(98%)	0,0	Serratia proteamaculans	WP_115059762.1 (PF06147.11)
13	6250-7272	←	340	DNA-binding protein (Conserved phage Cterminus Phg_2220_C)	313/339(92%)	0,0	Serratia liquefaciens ATCC 27592	AGQ28749.1 (PF09524.10)
14	7269-7391	←	40	DUF4222 domaincontaining protein (Domain of unknown function DUF4222)	39/40(98%)	3 * 10-29	Serratia liquefaciens	WP_116690624.1 (PF13973.6)
15	7441-8181	←	246	KilA-N domain-containing protein (KilA-N domain)	240/245(98%)	0,0	Serratia liquefaciens	WP_116690625.1 (PF04383.13)
16	8196-8468	←	90	hypothetical protein	88/90(98%)	6 * 10-68	Serratia liquefaciens	WP_116690626.1
17	8477-8791	←	104	hypothetical protein	98/104(94%)	4 * 10-72	Serratia proteamaculans	WP_115059769.1
18	8809-8961	←	50	XRE family transcriptional regulator	49/50(98%)	7 * 10-37	Serratia proteamaculans	WP_115059771.1
19	9156-9896	→	246	XRE family transcriptional regulator (Cro/C1-type HTH DNA-binding domain)	245/246(99%) (18-78)	0,0	Serratia proteamaculans	WP_115059773.1 (PF13443.6)
20	10433-10696	→	87	glycosyl transferase family 1, partial (Putative pyruvate format-lyase activating enzyme DUF1786)	18/40(45%)	1 * 10-08	Desulfosporosinus sp. BICA1-9	KJS90102.1 (PF08735.10)
21	10714-10923	→	69	lysine-2,3-aminomutase, EmpB	57/69(83%)	2 * 10-43	Serratia grimesii	WP_037419410.1
22	10953-11081	→	42	hypothetical protein HMPREF1564_3580 (Helical box domain of E3 ubiquitin-protein ligase HECW1)	28/38(74%)	1 * 10-19	Providencia alcalifaciens R90-1475	EUD08463.1 (PF18436.1)
23	11487-11699	→	70	hypothetical protein (Ribosomal protein L33)	67/70(96%)	2 * 10-52	Serratia proteamaculans	WP_115059007.1 (PF00471.20)
24	11693-11836	→	47	hypothetical protein M495_10455 (transmembrane motive)	47/47(100%)	8 * 10-36	Serratia liquefaciens ATCC 27592	AGQ30852.1
25	11839-12075	→	78	hypothetical protein	78/78(100%)	1 * 10-60	Serratia liquefaciens	WP_116690632.1
26	12079-12921	→	280	chromosome partitioning protein ParB (Crp-like helix-turnhelix domain)	274/280(98%)	0,0	Serratia proteamaculans	WP_012006454.1 (PF13545.6)
27	12905-13375	→	156	Gp37 (tail fiber protein)	49/113(43%)	1 * 10-25	Escherichia virus HK97	NP_037722.1
28	13372-14019	→	215	hypothetical protein (ASCH domain)	145/214(68%)	4 * 10-91	Serratia marcescens	WP_101456383.1 (PF04266.14)
29	14019-14240	→	73	molecular chaperone DnaJ (Restriction alleviation protein Lar)	64/70(91%)	4 * 10-50	Serratia proteamaculans	WP_085115658.1 (PF14354.6)
30	14233-14496	→	87	hypothetical protein	73/87(84%)	3 * 10-17	Serratia marcescens	WP_141958176.1
31	14489-14758	→	89	hypothetical protein	72/89(81%)	4 * 10-51	Serratia marcescens	WP_060429489.1
32	14777-15259	→	160	putative phage replication protein	17/48(35%)	2 * 10-06	Lactobacillus phage phiPYB5	YP_009167807.1
33	15259-15450	→	63	hypothetical protein BVG97_16260 ead/Ea22-like family protein	52/59(88%) 32/66(48%)	3 * 10-38 4 * 10-12	Serratia marcescens Serratia marcescens	ASL89067.1 WP_052475410.1
34	15443-15979	→	178	ead/Ea22-like family protein (Ead/Ea22-like protein)	48/57(84%)	1 * 10-32	Serratia quinivorans	WP_112347612.1 (PF13935.6)
35	15980-16234	→	84	hypothetical protein	78/84(93%)	1 * 10-62	Serratia plymuthica	WP_064798928.1
36	16244-16945	→	233	putative pmgU (Xeroderma pigmentosum group Bhelicase damage recognition domain)	25/43(58%)	2 * 10-16	Escherichia coli 2-474-04_S4_C2	KDZ03155.1 (PF18458.1)
37	16991-17260	→	89	uncharacterised protein	87/89(98%)	1 * 10-66	Serratia marcescens	SAY41700.1
38	17276-17494	→	72	hypothetical protein (Ribonuclease R winged-helix domain)	66/69(96%)	5 * 10-49	Serratia sp.	WP_046372826.1 (PF08461.10)
39	17514-17723	→	69	hypothetical protein	68/69(99%)	6 * 10-53	Serratia liquefaciens	WP_116691155.1
40	17726-18106	→	126	hypothetical protein	125/126(99%)	2 * 10-98	Serratia liquefaciens	WP_116690638.1
41	18122-18304	→	60	ANR family transcriptional regulator	59/60(98%)	2 * 10-44	Serratia quinivorans	WP_112347617.1
42	18307-18969	→	220	DNA methyltransferase (MT-A70) (S-adenosyl-Lmethionine-dependent methyltransferases)	208/220(95%)	4 * 10-164	Serratia liquefaciens	WP_046372823.1 (PF05063.14) (53335)
43	19351-20514	→	387	site-specific integrase (Phage integrase family) (Lambda integrase-like, catalytic core)	375/387(97%)	0,0	Serratia grimesii	WP_037419381.1 (PF00589.22) (56350)
44	20794-21699	←	301	hypothetical protein	262/301(87%)	0,0	Serratia marcescens	WP_060706314.1
45	21700-24081	←	793	tail lysin	83 to 176 25/95(26%) 154 to 220 19/76(25%) 295 to 306 6/12(50%) 1155 to 1219 20/71(28%) 560 to 567 5/8(63%)	1 * 10-04	Bacillus phage SageFayge	YP_009280906.1
46	24191-24364	→	57	lysyl-tRNA synthetase, class I (transmembrane domain)	43/56(77%)	5 * 10-32	Photorhabdus luminescens BA1	EYU16219.1
47	24402-24674	→	90	transcriptional regulator (lambda repressor-like DNA-binding domains)	84/90(93%)	2 * 10-64	Serratia marcescens	WP_072269370.1 (1.10.260.40)
48	24684-25814	→	376	Acyltransferase (Acyltransferase family)	339/376(90%)	0,0	Serratia marcescens	WP_072269371.1 (PF01757.22)
49	25845-26333	←	162	phage tail protein, partial (Pectinesterase domain)	51/62(82%)	8 * 10-36	Bacillus sp. SRB_28	RAN85254.1 (EC 3.1.1.11)
50	26377-27051	←	224	DUF2313 domain-containing protein (DUF2313)	211/224(94%)	2 * 10-165	Serratia marcescens	WP_060441827.1 (PF10076.9)
51	27048-28196	←	382	baseplate J/gp47 family protein (Baseplate J-like protein)	368/382(96%)	0,0	Serratia sp. C-1	WP_062790438.1 (PF04865.14)
52	28200-28637	←	145	putative tail protein (Phage protein GP46)	19 to 98 43/82(52%) 119 to 136 8/18(44%) 53 to 66 4/14(29%)	3 * 10-23	Enterobacteria phage SfI	WP_000424732.1 (PF07409.12)
53	28634-29224	←	196	Phage baseplate assembly protein V (Bacteriophage Mu Gp45 protein) (Phage spike trimer) (Acetyl-CoAcarboxylase domain)	182/196(93%) (19 to 117) (126 to 163) (83 to 145)	2 * 10-132	Serratia proteamaculans	SMB46877.1 (PF06890.12) (PF18715.1) (EC 6.4.1.2)
54	29224-30294	←	356	phage tail protein (Phage late control gene D protein GPD)	345/356(97%)	0,0	Serratia proteamaculans	WP_085118850.1 (PF05954.11)
55	30291-31694	←	467	dna circulation family protein (DNA circularisation protein N-terminus)	421/467(90%)	0,0	Lasius niger	KMQ87046.1 (PF07157.12)
56	31731-33650	←	639	lytic transglycosylase domain-containing protein (MSP7-like protein C-terminal domain)	385/655(59%)	0,0	Serratia sp. Nf2	WP_107228138.1 (PF12948.7)
57	33772-34062	←	96	phage tail assembly protein (Phage tail assembly chaperone proteins, E, or 41 or 14)	92/96(96%)	7 * 10-71	Serratia sp. C-1	WP_062790456.1 (PF10109.9)
58	34064-34432	←	122	phage tail protein (Phage tail tube protein)	122/122(100%)	1 * 10-92	Serratia sp. C-1	WP_062790459.1 (PF10618.9)
59	34442-35947	←	501	phage tail protein (Phage tail sheath protein beta-sandwich domain) (Phage tail sheath protein subtilisin-like domain) (Phage tail sheath C-terminal domain)	474/501(95%) (99 - 246) (210 - 373) (381 - 495)	0,0	Serratia proteamaculans	WP_085118840.1 (PF17481.2) (PF04984.14) (PF17482.2)
60	35944-36138	←	64	DUF2635 domain-containing protein (DUF2635)	59/64(92%) (3 - 48)	4 * 10-44	Serratia sp. C-1	WP_062790465.1 (PF10948.8)
61	36143-36685	←	180	ATP-binding protein (coiled-coil motive)	167/180(93%) (76 - 110)	2 * 10-129	Serratia sp. Nf2	WP_107228160.1
62	36682-37026	←	114	head-to-tail joining protein (Phage tail proteins domain)	34/104(33%)	7 * 10-10	Rhodobacter phage RcRhea	YP_009213476.1 (EC 2.40.10.180)
63	37026-37448	←	140	hypothetical protein (putative capsid protein)	109/140(78%)	2 * 10-56	Serratia symbiotica	WP_040264829.1 (PF12226.8)
64	37450-38499	←	349	major capsid protein (Phage major capsid	322/349(92%)	0,0	Citrobacter freundii	WP_115601857.1 (PF03864.15) (3.15.30.10) (3.30.1930.10) (3.15.30.10)
65	38603-39004	←	133	head decoration protein (Bacteriophage lambda head decoration protein D)	123/133(92%)	7 * 10-94	Serratia marcescens	WP_060425447.1 (PF02924.14)
66	39004-39603	←	199	Uncharacterised protein	168/201(84%)	3 * 10-89	Serratia marcescens	CVA09345.1
67	39607-40467	←	286	S49 family peptidase (2-enoyl-CoA Hydratase)	272/285(95%)	0,0	Serratia symbiotica	WP_006708310.1 (3.90.226.10)
68	40464-42044	←	526	phage portal protein (Phage portal protein, lambda family)	503/526(96%)	0,0	Serratia symbiotica	WP_040262924.1 (PF05136.13)
69	42110-42373	←	87	phage head-tail adapter protein (Head-to-tail joining protein W)	72/87(83%)	1 * 10-52	Photorhabdus luminescens	WP_105396969.1 (PF02831.15)
70	42382-44361	←	659	phage terminase large subunit family protein (Phage terminase large subunit GpA)	635/659(96%)	0,0	Serratia marcescens	WP_060425444.1 (PF05876.12)
71	44333-44932	←	199	terminase small subunit (Homeodomain-like domain)	50/201(25%)	4 * 10-06	Synechococcus phage S-LBS1	ATS93173.1 (PF13384.6)

Za pomocą narzędzia BLAST P udało się określić możliwe funkcje aż 54 ORFów. Dalsza analiza, bazująca na obecności domen białkowych i ukrytych modeli Markowa, umożliwiła określenie potencjalnych funkcji dla kolejnych 7 ORFów [Söding, 2004].