Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Wyniki i dyskusja/Określenie sekwencji cos

5.4 Określenie sekwencji cos

 Podczas analizy wyników sekwencjonowania zaobserwowano, że kontig zawierał na początku i na końcu tą samą sekwencję GCGCGCAATGCC (Rycina 21), co mogło być sekwencją cos odczytaną dla obu końców genomu niezależnie (taka możliwość istnieje tylko wówczas gdy terminaza, przecinając sekwencję cos, generuje jednoniciowe „lepkie” końce 5’), albo sekwencją powtórzoną w genomie lub po prostu pomyłką wygenerowaną przez program podczas składania kontigu.

Plik:Rycina 21 Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10.png

Rycina 21. Wyniki sekwencjonowania genomu φOS10. Na obu ramionach genomu widoczna jest sekwencja GCGCGCAATGCC [Decewicz & Radlińska, dane nieopublikowane].

Argumentem przemawiającym za tą pierwszą możliwością było przypisanie funkcji produktowi pierwszego genu (mała podjednostka terminazy), znajdującego się na prawym ramieniu kontigu. Jak wspomniano w Podrozdziale 1.5.1, w przypadku występowania sekwencji cos jej położenie w genomie jest konserwowane i znajduje się w regionie niekodującym, tuż przed genem kodującym małą podjednostkę terminazy. Aby określić faktyczną sekwencję końców genomowego DNA φOS10, a zatem wykluczyć pomyłkę wygenerowaną przez program do składania kontigu, wykonano następujący eksperyment. Genomowy DNA φOS10 przecięto enzymem Nco I (jedno z miejsc dla Nco I znajduje się w odległości 1967 bp od prawego końca). Następnie użyto Fragment Klenowa Polimerazy I, aby usunąć „lepkie” końce uzyskanych fragmentów restrykcyjnych, a następnie fragment o wielkości 1967 bp reizolowano z żelu (Rycina 22).

Rycina 22. Fragment prawego ramienia genomu φOS10 reizolowany z żelu.

Zakładając, że końce liniowego genomu φOS10 zawierają jednoniciowe odcinki (są „lepkie”), wspomniany fragment DNA zawierał „lepki” koniec po cięciu Nco I oraz „lepki” koniec po cięciu terminazą, które zostały następnie wypełnione przez enzym Fragment Klenowa Polimerazy I. Ten odcinek DNA sklonowano w wektorze pUC19 strawionym uprzednio enzymem Sma I i oddano do sekwencjonowania. Sekwencję prawego ramienia po zastosowaniu Fragmentu Klenowa przedstawia Rycina 23.

5’CATGGCTCATTGGTTTCCAGAT[…]CAACTATCGATCTGCGTCTTGCGCCGCGCGTTACGG 3’ 3’GTACCGAGTAACCAAAGGTCTA[…]GTTGATAGCTAGACGCAGAACGCGGCGCGCAATGCC 5’

Rycina 23. Sekwencja prawego ramienia genomu φOS10 po zastosowaniu Fragmentu Klenowa Polimerazy I. Kolorem czerwonym dopisano sekwencję wygenerowaną przez Fragment Klenowa.

Natomiast, aby sprawdzić czy sekwencja GCGCGCAATGCC występuje tylko raz (albo czy jest zduplikowana) w genomie φOS10 – przeprowadzono amplifikację regionu zawierającego tę sekwencję z użyciem starterów, które ją flankują (Podrozdziały 3.3.1 i 4.15) z wykorzystaniem jako matrycy DNA chromosomowy wyizolowany z lizogena tj. szczepu Serratia sp. OS10L (opis uzyskania lizogenia w Podrozdziale 5.5). Uzyskany produkt PCR sklonowano w wektorze pUC19 strawionym uprzednio enzymem Sma I i oddano do sekwencjonowania. Wynik tego eksperymentu wykazał, że sekwencja GCGCGCAATGCC występuje w genomie profaga tylko raz, co pozwala wnioskować, że obecność tej sekwencji na obu końcach kontigu jest produktem specyficznego endonukleolitycznego cięcia DNA przez terminazę. Nić górna w sekwencji GCGCGCAATGCC została przecięta przed pierwszą guaniną na końcu 5’, tak samo jak nić do niej komplementarna. W ten sposób zostały wygenerowane 12 nt jednoniciowe końce. Na Rycinie 24 przedstawiono schemat poglądowy obrazujący sekwencję cos obecną w sekwencji profagowej Serratia sp. OS10L oraz po jej przecięciu w genomie faga OS10.

A) TCCCTGCACTTTTGTAAAGCACGGGCATTGCGCGCCGCGTTCTGCGTCTAGCTATCAACT AGGGACGTGAAAACATTTCGTGCCCGTAACGCGCGGCGCAAGACGCAGATCGATAGTTGA B)  5’ GGCATTGCGCGCCGCGTTCTGCGTCTAGCTATCAACT  3’ GCGCAAGACGCAGATCGATAGTTGA TCCCTGCACTTTTGTAAAGCACG 3’ AGGGACGTGAAAACATTTCGTGCCCGTAACGCGCG 5’

Rycina 24. Sekwencja cos, zaznaczona kolorem czerwonym. Sekwencja replikowanego genomu przed cięciem z udziałem terminazy oraz w profagu. Strzałkami zaznaczono miejsca cięć (A), po przecięciu zostały wygenerowane jednoniciowe odcinki – tzw. „lepkie” końce 5’ (B) [Radlińska, dane nieopublikowane].