Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Metody/Badanie jednego etapu replikacji (One-Step Growth) faga φOS10

4.19 Badanie jednego etapu replikacji (One-Step Growth) faga φOS10

 Procedura zastosowana w niniejszej pracy bazowała na metodyce Kropińskiego [Kropiński, 2018] z pewnymi modyfikacjami (Podrozdział 4.19.3). Do badania wykorzystano szczep wrażliwy Serratia sp. OS10.

4.19.1 Określenie miana hodowli gospodarza dla OD ₆₀₀ = 0,5

 Nocną hodowlę OS10, pochodzącą z pojedynczej kolonii, odmładzano w płynnej pożywce LB w 3 wariantach, tj. w stosunkach objętościowych: 1:20, 1:50 oraz 1:100. Dla każdego z wariantów określano przybliżony czas, w jakim każda z odmładzanych hodowli osiąga OD ₆₀₀ = 0,5 (z zastrzeżeniem, iż są to wartości orientacyjne, mogące się różnić w zależności od miana nocnej hodowli, które za każdym razem jest inne). Po określeniu czasu odmładzania hodowli do osiągnięcia OD ₆₀₀ = 0,5 i uzyskaniu odmłodzonej hodowli o wspomnianej OD, wykonywano rzędy rozcieńczeń odmłodzonej hodowli w podłożu płynnym LB. Wykonywano posiew powierzchniowy rozcieńczeń 10 ^-4, 10 ^-5 i 10^-6 na podłożu stałym LB – tak przygotowane szalki inkubowano przez noc w temperaturze 20 °C, liczono wyrosłe kolonie i określano miano odmłodzonej hodowli OS10 o OD ₆₀₀ = 0,5.

4.19.2 Określenie wartości MOI i odsetku jednokrotnych infekcji

 W oparciu o schemat przedstawiony na Rycinie 14 wyliczano MOI dla kolby adsorpcyjnej.

Plik:Rycina 14 Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10.png

Rycina 14. Schemat badania jednego etapu replikacji faga. [Kropiński 2018, zmienione].

 Zgodnie z procedurą w kolbie adsorpcyjnej znalazło się 0,1 ml zawiesiny cząstek fagowych o mianie 10⁷ PFU/ml, co było tożsame z ilością 10⁶ PFU. Do kolby adsorpcyjnej przenoszono 9,9 ml odmłodzonej hodowli szczepu wrażliwego o OD ₆₀₀ = 0,5. Po wcześniejszym określeniu miana komórek w hodowli o OD ₆₀₀ = 0,5 i przemnożeniu tego miana przez objętość 9,9 ml uzyskiwano przewidywaną ilość jednostek tworzących kolonie, zaś dzieląc przez tą wartość ilość cząstek fagowych (10⁶ PFU) uzysk uzyskiwano ilościowy stosunek infekcyjnych cząstek bakteriofagowych do infekowanych komórek gospodarza – czyli MOI. W oparciu o MOI stosowane w procedurze, wyznaczano jaki odsetek wśród wszystkich zainfekowanych komórek szczepu wrażliwego stanowią komórki zainfekowane tylko 1 cząstką infekcyjną. W tym celu stosowano metodę statystyczną opisaną w czasopiśmie naukowym The Journal of general physiology [Ellis & Delbrück, 1939]. Zaprezentowany w publikacji wzór (Rycina 15) określał dla dowolnej komórki bakteryjnej prawdopodobieństwo zainfekowania przez „n” cząstek infekcyjnych – gdzie „m” jest wartością MOI, zaś „e” jest liczbą Eulera.

$P(n)={\frac {m^{n}\cdot e^{-m}}{n!}}$

Rycina 15. Prawdopodobieństwo infekcji 1 komórki „n” cząstkami wirusowymi [Wikipedia, na podstawie: Ellis & Delbrück, 1939].

 W oparciu o powyższy wzór wyliczano, jaki odsetek bakterii nie został zainfekowany – co definiowało wyrażenie „P(0)”. Po odjęciu od wartości „1” odsetku niezainfekowanych bakterii otrzymywano łączny odsetek zainfekowanych bakterii (przynajmniej 1 cząstką wirusową) opisany wzorem „1-P(0)”. Następnie w oparciu o powyższy wzór obliczano odsetek komórek zainfekowanych przez dokładnie 1 cząstkę infekcyjną – wyrażony jako „P(1)”. W oparciu o tak uzyskane dane wykonywano rachunek według wzoru „( P(1) / [1P(0)] )* 100%”, który opisywał procentowy udział komórek bakteryjnych zainfekowanych przez dokładnie 1 cząstkę infekcyjną wśród wszystkich zainfekowanych komórek bakteryjnych dowolną ilością cząstek infekcyjnych większą od „0”. Im odsetek ten był bliższy 100%, tym z większą pewnością można było uznać ilość łysinek zaobserwowanych na szalkach za ilość cząstek infekcyjnych obecnych w preparacie (w czasie pomiaru).

4.19.3 Określenie czasu latencji i plonu fagowego

 Odmładzanie nocnej hodowli szczepu OS10 wykonywano w pożywce płynnej LB wzbogaconej o chlorek wapnia o końcowym stężeniu 2 mM, którego dodatek zwiększał wydajność adsorpcji cząstek fagowych do komórek szczepu Serratia sp. OS10. Po uzyskaniu OD ₆₀₀ = 0,5 przenoszono 9,9 ml odmłodzonej hodowli do kolby adsorpcyjnej. Do kolby adsorpcyjnej dodawano 0,1 ml zawiesiny fagowej o mianie 10⁷ PFU/ml, jednocześnie zaczynając mierzenie czasu. Mieszaninę inkubowano w wytrząsarce w temperaturze 20 °C. Po 5 minutach przenoszono 0,1 ml zawartości z kolby adsorpcyjnej do „kolby A” zawierającej 9,9 ml pożywki płynnej LB, której zawartość następnie inkubowano w temperaturze 20 °C z wytrząsaniem (kolba A stanowiła jednocześnie odmłodzenie hodowli oraz 100-krotne rozcieńczenie mieszaniny z kolby adsorpcyjnej). Po upływie 5 minut

pobierano z „kolby A” mieszaninę w ilości: (i) 1 ml do probówki opisanej literą „K” zawierającej 50 µl chloroformu; (ii) 100 µl do probówki oznaczonej symbolem „A1” zawierającej 150 µl nocnej hodowli OS10 oraz po określeniu czasu latencji w następnych podejściach dodawano (iii) 1 ml do „kolby B” zawierającej 9,9 ml jałowej pożywki płynnej LB (co stanowi 10-krotne rozcieńczenie zawartości kolby A). Zawartość probówki opisanej literą „K” mieszano przez około 1 min, po czym przechowywano w lodzie – preparat ten stanowił układ odniesienia, obrazujący ilość niezaadsorbowanych cząstek fagowych. Zawartość kolby B wytrząsano równolegle z wytrząsaniem kolby A, a po kolejnych 5 minutach 1 ml zawartości z kolby B przenoszono do kolby C zawierającej 9 ml jałowej pożywki LB. Do probówki z oznaczeniem „A1” po wymieszaniu i 5-minutowej inkubacji dodawano 4 ml agaru półpłynnego, mieszano i rozprowadzano po agarze dolnym na szalce podpisanej numerem seryjnym „A1” zgodnie z procedurą opisaną w Podrozdziale 4.1. Odstępy między kolejnymi pomiarami następowały zależnie od potrzeb – wynosiły od 5 do 15 minut. Każdy z pomiarów miał swój indywidualny numer seryjny składający się z litery oznaczającej kolbę oraz liczby porządkowej dla danego momentu pomiarowego (przy czym pomiary dla kolb A, B i C wykonane w tym samym momencie od infekcji w kolbie adsorpcyjnej miały ten sam numer i różniły się tylko literą). W pierwszym podejściu określano: czy czas latencji jest krótszy od 60 minut; w związku z czym wszystkie 12 pomiarów odbywało się tylko dla kolby A i między każdymi dwoma był odstęp czasowy 5 minut. W następnym podejściu wykonywano 19 pomiarów (pomiary A1-A5 wykonywane co 10 minut, a pomiary A5-A19 wykonywane co 5 minut). Po określeniu czasu latencji wykonywano kolejne powtórzenie, tym razem w odstępach 15-minutowych dla pomiarów A1-A6 oraz w odstępach 5-minutowych dla pomiarów A6-A14 i B8-B20. Celem wprowadzenia do doświadczenia kolby B było określenie, czy faza plateau ustala się w obrębie 10-krotnego rozcieńczenia hodowli z zachowaniem policzalności łysinek na szalce (z kolby B), czy dopiero w obrębie 100-krotnego rozcieńczenia hodowli (z kolby C). Po ustaleniu czasu latencji, tj. czasu, po którym nastąpił wysyp nowych cząstek infekcyjnych z zainfekowanych komórek gospodarza, postanowiono, że w następnym podejściu do eksperymentu, na około 10 minut przed przewidywanym wysypem, zbierane będą z kolby B próbki po 100 µl równolegle z dotychczas zbieranymi pomiarami z kolby A – dzięki czemu określano, po jakim czasie kończył się pierwszy wysyp i zachodziła faza drugiego plateau. Czwarte i piąte podejście przewidywały wykorzystanie 3 kolb: kolby A, kolby B i kolby C, dla których wiadomo było zarówno: ile wynosi czas latencji oraz jaki jest czas, w którym dojdzie do drugiego plateau (Rycina 16).

Plik:Rycina 16 Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10.png

Rycina 16. Wykres zależności miana faga w hodowli od czasu [Kropiński, 2018, zmienione].

Podczas projektowania wykresu w oparciu o ilość łysinek mnożono ilość tych łysinek przez współczynnik (1000 µl/X)*10^Y, gdzie X to objętość nakroplenia (tu 10 µl) lub objętość próbki badanej w teście pełnoszalkowym (tu 100 µl), zaś Y to rząd wielkości rozcieńczenia próbki względem zawartości kolby A. Wykres przedstawiano w formie diagramu punktowego. W późniejszym wariancie procedury odpowiednikiem kolejnych kolb były kolejne 10-krotne rozcieńczenia dla każdej próbki z kolby A.

Przypisy