Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Metody
Wykonywano szereg 10-krotnych rozcieńczeń badanej zawiesiny. Na warstwę agaru górnego (powstałą ze zmieszania 4 ml LB półpłynnego z 150 µl nocnej hodowli gospodarza) nakraplano próbki każdego rozcieńczenia o objętości 2-10 µl, a następnie suszono każdą szalkę przy płomieniu palnika i inkubowano przez noc. Spośród wszystkich szalek wybierano rozcieńczenie, które umożliwiało policzenie łysinek. 100 µl wybranego rozcieńczenia łączono z 150µl nocnej hodowli wrażliwego gospodarza, a otrzymaną mieszaninę po około 5minutowej inkubacji mieszano z 4 ml LB półpłynnego, wylewano na szalkę z LB stałym i równomiernie rozprowadzono po powierzchni. Po zastygnięciu górnej warstwy, szalki inkubowano przez noc w temperaturze 20 °C.
Pojedynczą łysinkę zawieszano w 500 µl buforu SM przez noc i inkubowano w temperaturze około 4 °C. Zawiesinę mianowano tak jak w pkt. 4.1, a następnie wykonywano test pełnoszalkowy dla wybranych rozcieńczeń. Agar półpłynny zalewano 4 ml buforu SM, a następnie inkubowano w temperaturze 4 °C przez noc. Zawieszone w buforze SM łysinki zbierano jałową głaszczką, a otrzymaną zawiesinę wirowano przy prędkości 13 tys. rpm przez 10 min. Supernatant przenoszono do kolb płaskodennych. Do 10 ml zawiesiny dodawano 200 µl chloroformu (w celu zabicia pozostałych w zawiesinie bakterii), wytrząsano z prędkością 120 rpm, w temperaturze 20 °C przez 30 minut, a następnie wirowano z prędkością 13 tys. rpm przez 10 minut. Uzyskane supernatanty przechowywano w temperaturze 4 °C.
Do 1 ml zawiesiny cząstek dodawano RNazę i DNazę do uzyskania końcowych stężeń 10 µg/ml. Mieszaniny inkubowano przez godzinę w temperaturze 37 °C. Dodawano roztwór EDTA do końcowego stężenia 20 mM i inkubowano w temperaturze 65 °C przez 30 minut. Do roztworów dodawano proteinazę K do końcowego stężenia 100 µg/ml oraz SDS do końcowego stężenia 0,5%. Próbki mieszano poprzez odwracanie, po czym inkubowano w temperaturze 56 °C przez 1,5 godziny. Następnie przeprowadzono ekstrakcję białek mieszaniną fenol/chloroform w objętościach identycznych z objętościami próbek, energicznie mieszano poprzez odwracanie aż do utworzenia się homogennej emulsji. Wirowano z prędkością 3000 g przez 6 min w celu rozdzielenia fazy wodnej i fazy organicznej. Zbierano fazę wodną i procedurę powtarzano aż do zaniku interfazy. Próbki oczyszczono z resztek fenolu poprzez ekstrakcję chloroformem, wirowano z prędkością 3000 g przez 6 min w celu rozdzielenia fazy wodnej i fazy organicznej. Do każdej z próbek dodawano izopropanol w proporcji objętościowej 1:1. Próbki mieszano i inkubowano w temperaturze -20 °C przez noc. Próbki wirowano przy prędkości 13,2 tys. rpm przez 3 min w 4 °C. Supernatant usuwano pipetą, a osad płukano 70%-owym etanolem, próbki wirowano przez 5 min przy prędkości 13,2 tys. rpm w temperaturze 4 °C. Osad suszono z resztek etanolu przez około 15-30 minut w temperaturze pokojowej, DNA zawieszono w 40 µl wody destylowanej. Pomiar stężeń DNA wykonano z użyciem aparatu Nano-Drop zgodnie z instrukcją podaną przez producenta.
Trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi przeprowadzano w oparciu o wytyczne wskazane przez producenta, uwzględniające odpowiednie bufory i temperatury inkubacji. Inkubacje trwały od 1 do 3 godzin. Wykorzystywano 1 jednostkę enzymu na 10 ng DNA.
Na potrzeby naszych badań wykorzystywano żel agarozowy na bazie 1x buforu TBE (Tris-boran-EDTA) przygotowywany w proporcji 0,8 g agarozy na 100 ml buforu [Lee i in., 2012]. Do każdej z próbek dodawano roztwór obciążający w proporcji 1 µl roztworu na każde 5 µl próbki. Elektroforezę przeprowadzano przy napięciu 8 V/cm przez około 1 godzinę. Żel umieszczano w wodnym roztworze bromku etydyny i inkubowano przez około 5-10 min, nadmiar bromku etydyny odpłukiwano w wodzie. Zdjęcia cyfrowe wykonywano w świetle UV przy czasie ekspozycji 0,133 ms i długości fali 300 nm. Zdjęcie korygowano pod kątem jasności i kontrastu, po czym zapisywano.
Żel agarozowy umieszczano na szybie transilluminatora, po czym w świetle UV wybierano i wycinano właściwy prążek zawierający DNA. DNA izolowano z użyciem procedury Gel-Out opisanej w instrukcji, załączonej do zestawu komercyjnego [A&A Biotechnology].
Do próbki dodawano: (i) bufor LB o stężeniu 10x do końcowego stężenia 1x; (ii) roztwór dNTP-ów do uzyskania końcowego stężenia 0,05 mM; (iii) fragment Klenowa w proporcji 1 µl na każde 40 µl końcowej objętości mieszaniny; (iv) wodę destylowaną dla dopełnienia do planowanej objętości. Próbkę inkubowano w temperaturze 37 °C przez 10 min, enzym inaktywowano w 75 °C przez 10 min. Próbkę inkubowano w lodzie przez 3 min.
Do próbki dodawano: (i) bufor LB o stężeniu 10x do końcowego stężenia 1x; (ii) roztwór dNTP-ów do uzyskania końcowego stężenia 0,1 mM; (iii) polimerazę faga T4 w proporcji 1 µl na każde 100 µl końcowej objętości mieszaniny; (iv) wodę destylowaną dla dopełnienia do planowanej objętości. Próbkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 min, enzym inaktywowano w 75 °C przez 10 min. Próbkę inkubowano w lodzie przez 3 min.
Reakcję ligacji przeprowadzano w temperaturze pokojowej przez noc. Używano ligazy faga T4 oraz odpowiedniego buforu do ligacji.
Pomiar gęstości optycznej wykonywano przy długości fali λ = 600 nm, z użyciem spektrofotometru UVmini-1240 (Podrozdział 3.9).
Na dzień przed właściwą procedurą, przygotowano nocną hodowlę poprzez zawieszenie czystej kultury z posiewu redukcyjnego szczepu E. coli TOP 10 F’ w 3 ml jałowego podłoża płynnego LB z późniejszym inkubowaniem tej hodowli przez około 21 godzin w wytrząsarce z ustawioną temperaturą 37 °C i szybkością wytrząsania 100 rpm. Nocną hodowlę E. coli TOP 10 F’ (Podrozdział 3.2) odmładzano, przenosząc 1 ml hodowli do 50 ml płynnego podłoża LB o temperaturze 37 °C. Hodowlę prowadzono aż do osiągnięcia OD600 około 0,4. Kolbę z odmładzaną hodowlą inkubowano w lodzie przez 30 min. Zawartość kolby przenoszono do probówek wirowniczych i wirowano z prędkością 3700 rpm w temperaturze 4 °C przez 10 min. Supernatant usuwano, osad zawieszano w 1 ml buforu TFB I (Podrozdział 3.5.3), próbki dopełniano buforem TFB I do końcowej objętości 33 ml. Próbki mieszano poprzez odwracanie, inkubowano w lodzie przez 20 min i wirowano z prędkością 3500 rpm w temperaturze 4 °C przez 10 min. Supernatant usuwano, osad zawieszano w 3 ml buforu TFB II (Podrozdział 3.5.3). Próbki utrzymywano w temperaturze lodu podczas przenoszenia do nowych probówek w porcjach po 100 µl i zamrażano w temperaturze -80 °C.
Próbkę 100 µl bakterii kompetentnych (Podrozdział 4.11) rozmrażano, utrzymując w temperaturze lodu. Dodawano 10 µl mieszaniny ligacyjnej (Podrozdział 4.9) i mieszano z użyciem pipety automatycznej. Próbki inkubowano w lodzie przez 30 min. Po tym czasie poddawano je szokowi cieplnemu w temperaturze 42 °C przez 1,5 min, a następnie inkubowano w lodzie przez 2 minuty. Dodawano 900 µl płynnej pożywki LB, mieszano próbkę z użyciem pipety i inkubowano w temperaturze 37 °C przez godzinę. Wykonywano posiew powierzchniowy 100 µl próbki na podłoże stałe LB wzbogacone ampicyliną, IPTG i X-gal (posiew próbki niezatężonej). Pozostałą próbkę o objętości 900 µl wirowano przez 1 min z prędkością 6000 rpm, pobierano 100 µl supernatantu, odrzucano jego pozostałą ilość, pozostały pelet zawieszano w pobranych 100 µl supernatantu i posiewano na powierzchnię podłoża stałego LB wzbogaconego o ampicylinę, IPTG i X-gal (posiew próbki zatężonej). Hodowlę inkubowano w temperaturze 37 °C przez noc. Wybierano co najmniej 1 białą kolonię, pobierano ezą i zaszczepiano w oddzielnych probówkach z 4 ml podłoża płynnego LB z dodatkiem ampicyliny o końcowym stężeniu 150 mM. Probówki inkubowano z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 37 °C.
Przenoszono do probówki 1,5ml nocnej hodowli (Podrozdział 4.12), wirowano z prędkością 6000 rpm przez 1 min, supernatant usuwano. Do tej samej probówki dodawano 1,5 ml nocnej hodowli i wyżej opisane czynności wykonywano ponownie. Uzyskany osad zawieszano w buforze STE dodawanym do końcowej objętości 1 ml, próbkę wirowano z prędkością około 6000 rpm przez 1 min, supernatant usuwano. Osad zawieszano w 200 µl buforu L1. Dalsze etapy przeprowadzano zgodnie z instrukcją załączoną do zestawu komercyjnego do izolacji plazmidowego DNA. Próbki plazmidowego DNA przechowywano zamrożone w temperaturze -20 °C.
Wykonywano pomiar stężenia matrycy dla badanej próbki. W oparciu o pomiar wyliczano potrzebną ilość matrycy, którą następnie dodawano do mieszaniny reakcyjnej (objętość matrycy dostarczająca plazmidowy albo wirusowy DNA do mieszaniny reakcyjnej w ilości od 1 pg do 10 ng). Reakcję przeprowadzano według programu termocyklera (Tabela 6).
| Etap | Temperatura | Czas | |
| Denaturacja wstępna | 98 °C | 30 sek | |
| 35 cyklów | Denaturacja | 98 °C | 10 sek |
| Hybrydyzacja startera | 64 °C | 30 sek | |
| Elongacja | 72 °C | 30 sek | |
| Elongacja uzupełniająca | 72 °C | 3 min | |
| Zatrzymanie | 4 °C | ∞ | |
Buforem stosowanym do reakcji PCR był bufor HF (ang. High Fidelity) (Podrozdział 3.6). Enzymem stosowanym do reakcji PCR była polimeraza DNA Phusion (Podrozdział 3.6). Skład mieszaniny oraz kolejność dodawania komponentów przedstawia Tabela 7:
| kolejność | Składnik | Objętość | Końcowe stężenie |
| 1 | woda destylowana | dopełniająco do 50 µl | |
| 2 | 5X bufor Phusion HF | 10 µl | 1X |
| 3 | 10 mM dNTP-y | 1 µl | 200 µM |
| 4 | 10 µM starter Forward | 2,5 µl | 0,5 µM |
| 5 | 10 µM starter Reverse | 2,5 µl | 0,5 µM |
| 6 | matryca DNA | zmiennie | 1 pg – 10 ng |
| 7 | polimeraza DNA Phusion | 0,5 µl | 1U |
Polimerazę DNA dodawano tuż przed umieszczeniem próbek w termocyklerze. Po zakończeniu programu wykonywano kontrolę poprzez nałożenie na żel agarozowy około 10 µl produktu PCR wraz z miarką molekularną i wykonywanie elektroforezy – obecność prążka na przewidywanej wysokości świadczyła o udanym wykonaniu procedury.
W wariancie procedury opisanej w Podrozdziale 4.14 wykorzystywano matrycę w postaci chromosomalnego DNA ze szczepu lizogennego. Przebieg był następujący: (i) do PCR-ówki dodawano 20 µl buforu lizującego; (ii) na czubek wymiennej końcówki pipety automatycznej pobierano 1 kolonię szczepu lizogennego; (iii) pobraną kolonię zawieszano w 20 µl buforu lizującego; (iv) mieszaninę inkubowano przez 10 min w temperaturze 98 °C, (v) zawartość PCR-ówki przenoszono do nowej probówki typu Eppendorf i dopełniano wodą destylowaną do końcowej objętości 200 µl, po czym próbkę mieszano; (vi) próbkę zawierającą rozcieńczony lizat bakteryjny wirowano przez 2 min z prędkością 13 tys. rpm (w celu osadzenia szczątków bakteryjnych na dnie probówki); (vii) supernatant z lizatu bakteryjnego dodawano do mieszaniny amplifikacyjnej (PCR) w ilości około 1 µl.
Sekwencjonowanie wykonywano w ramach usługi zewnętrznej zleconej Pracowni Sekwencjonowania DNA IBB PAN.
Do zidentyfikowania ORFów w sekwencji genomu badanego bakteriofaga wykorzystywano program RAST [Aziz, 2008] (Podrozdział 1.6.1).
Wykryte ORFy (Podrozdział 4.17.1) wizualizowano przy pomocy programu Artemis (Podrozdział 1.6.2), a wygenerowane w nim sekwencje aminokwasowe produktów białkowych wykrytych ORF-ów dopasowywano do zdeponowanych w bazie NCBI sekwencji aminokwasowych znanych białek za pomocą programu BLAST P (Podrozdział 1.6.3). Potencjalne domeny białkowe wykrywano przy pomocy programu HMMER wyszukującego ukryte modele Markowa [https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer] (Podrozdział 1.6.4). Narzędzia BLAST N (Podrozdział 1.6.3), również dostępnego na stronie NCBI, używano do wykonywania globalnego dopasowania sekwencji nukleotydowej genomu badanego bakteriofaga do zdeponowanych w bazie sekwencji nukleotydowych oraz do dopasowania sekwencji badanego genomu z sekwencjami nukleotydowymi genomów znanych bakteriofagów Serratia. Fragmenty genomu badanego bakteriofaga, które wykazywały homologię z sekwencjami nukleotydowymi genomów znanych bakteriofagów Serratia analizowano z użyciem narzędzi: Serial Cloner, w którym zaznaczano i kopiowano sekwencje homologiczne na podstawie koordynatów podanych przez BLAST N oraz BLAST X, dzięki któremu przewidywano funkcje produktów białkowych genów zawartych w tychże sekwencjach.
Do określenia przynależności taksonomicznej badanego bakteriofaga wykorzystywano narzędzie dostępne na stronie http://biodev.cea.fr/virfam/. Plik tekstowy zawierający sekwencje aminokwasowe potencjalnych produktów białkowych ORF w formacie FASTA implementowano do programu i wydawano dyspozycję analizy do realizacji. Wynik analizy białek strukturalnych z pliku tekstowego wykonanej przez program VIRFAM otrzymywano w formie wiadomości email, w której zawarte były informacje o przynależności badanego bakteriofaga do rodziny taksonomicznej oraz klastra (Podrozdział 1.6.5).
Wirtualne cięcia wykonywano z użyciem programu Serial Cloner. Program w oparciu o zaimplementowaną sekwencję nukleotydową badanego bakteriofaga, wybrane enzymy restrykcyjne i informację o topologii cząsteczki kwasu nukleinowego (kolista lub liniowa) generował grafikę ilustrującą oczekiwany elektroforegram, co umożliwiało wybór właściwych enzymów restrykcyjnych na potrzeby badań. Wirtualnych cięć nie opublikowano w niniejszej pracy.
Wyszukiwanie genów tRNA odbywało się z użyciem programu ARAGORN. Po zaimplementowaniu do programu sekwencji nukleotydowej genomu badanego faga program dokonywał analizy, której wyniki wyświetlane były w formie tekstowej (odczytu z programu ARAGORN nie zamieszczono w niniejszej pracy).
Na pełen przebieg eksperymentu (według procedury z Podrozdziału 4.1) składały się trzy próby biologiczne. W każdej próbie wykonywano 8 pomiarów w kolejnych punktach czasowych począwszy od zmieszania bakteryjnego gospodarza z bakteriofagiem, to jest w: 1. minucie, 2. minucie, 5. minucie, 10. minucie, 15. minucie, 20. minucie, 25. minucie oraz 30. minucie. Zarówno w próbie badanej i kontrolnej wykorzystywano po 10µl zawiesiny faga φOS10 o mianie 2,5 * 1010 PFU/ml. Próbą badaną był 1ml nocnej hodowli szczepu Serratia sp. OS10 (gospodarz) zmieszany z 10µl zawiesiny faga φOS10 o mianie 2,5 * 1010 PFU/ml. Próbą kontrolną był 1ml pożywki płynnej LB zmieszanej z 10µl zawiesiny faga φOS10 o mianie 2,5 * 1010 PFU/ml. Próby mieszano poprzez przechylanie. W każdym kolejnym punkcie czasowym pobierano do nowych probówek po 100 µl mieszaniny badanej i mieszaniny kontrolnej. Pobrane próbki wirowano przez 1 minutę z prędkością 10 tys. rpm, z każdej pobierano po 50 µl supernatantu do nowych, opisanych probówek i umieszczano w lodzie. Próbki nanoszono metodą nakropleń (Podrozdział 4.1) na szalki dwuwarstwowe zawierające nocną hodowlę gospodarza według schematu na Rycinie 13.
Procedura zastosowana w niniejszej pracy bazowała na metodyce Kropińskiego [Kropiński, 2018] z pewnymi modyfikacjami (Podrozdział 4.19.3). Do badania wykorzystano szczep wrażliwy Serratia sp. OS10.
Nocną hodowlę OS10, pochodzącą z pojedynczej kolonii, odmładzano w płynnej pożywce LB w 3 wariantach, tj. w stosunkach objętościowych: 1:20, 1:50 oraz 1:100. Dla każdego z wariantów określano przybliżony czas, w jakim każda z odmładzanych hodowli osiąga OD 600 = 0,5 (z zastrzeżeniem, iż są to wartości orientacyjne, mogące się różnić w zależności od miana nocnej hodowli, które za każdym razem jest inne). Po określeniu czasu odmładzania hodowli do osiągnięcia OD 600 = 0,5 i uzyskaniu odmłodzonej hodowli o wspomnianej OD, wykonywano rzędy rozcieńczeń odmłodzonej hodowli w podłożu płynnym LB. Wykonywano posiew powierzchniowy rozcieńczeń 10 -4, 10 -5 i 10-6 na podłożu stałym LB – tak przygotowane szalki inkubowano przez noc w temperaturze 20 °C, liczono wyrosłe kolonie i określano miano odmłodzonej hodowli OS10 o OD 600 = 0,5.
W oparciu o schemat przedstawiony na Rycinie 14 wyliczano MOI dla kolby adsorpcyjnej.
Zgodnie z procedurą w kolbie adsorpcyjnej znalazło się 0,1 ml zawiesiny cząstek fagowych o mianie 107 PFU/ml, co było tożsame z ilością 106 PFU. Do kolby adsorpcyjnej przenoszono 9,9 ml odmłodzonej hodowli szczepu wrażliwego o OD 600 = 0,5. Po wcześniejszym określeniu miana komórek w hodowli o OD 600 = 0,5 i przemnożeniu tego miana przez objętość 9,9 ml uzyskiwano przewidywaną ilość jednostek tworzących kolonie, zaś dzieląc przez tą wartość ilość cząstek fagowych (106 PFU) uzysk uzyskiwano ilościowy stosunek infekcyjnych cząstek bakteriofagowych do infekowanych komórek gospodarza – czyli MOI. W oparciu o MOI stosowane w procedurze, wyznaczano jaki odsetek wśród wszystkich zainfekowanych komórek szczepu wrażliwego stanowią komórki zainfekowane tylko 1 cząstką infekcyjną. W tym celu stosowano metodę statystyczną opisaną w czasopiśmie naukowym The Journal of general physiology [Ellis & Delbrück, 1939]. Zaprezentowany w publikacji wzór (Rycina 15) określał dla dowolnej komórki bakteryjnej prawdopodobieństwo zainfekowania przez „n” cząstek infekcyjnych – gdzie „m” jest wartością MOI, zaś „e” jest liczbą Eulera.
W oparciu o powyższy wzór wyliczano, jaki odsetek bakterii nie został zainfekowany – co definiowało wyrażenie „P(0)”. Po odjęciu od wartości „1” odsetku niezainfekowanych bakterii otrzymywano łączny odsetek zainfekowanych bakterii (przynajmniej 1 cząstką wirusową) opisany wzorem „1-P(0)”. Następnie w oparciu o powyższy wzór obliczano odsetek komórek zainfekowanych przez dokładnie 1 cząstkę infekcyjną – wyrażony jako „P(1)”. W oparciu o tak uzyskane dane wykonywano rachunek według wzoru „( P(1) / [1P(0)] )* 100%”, który opisywał procentowy udział komórek bakteryjnych zainfekowanych przez dokładnie 1 cząstkę infekcyjną wśród wszystkich zainfekowanych komórek bakteryjnych dowolną ilością cząstek infekcyjnych większą od „0”. Im odsetek ten był bliższy 100%, tym z większą pewnością można było uznać ilość łysinek zaobserwowanych na szalkach za ilość cząstek infekcyjnych obecnych w preparacie (w czasie pomiaru).
Odmładzanie nocnej hodowli szczepu OS10 wykonywano w pożywce płynnej LB wzbogaconej o chlorek wapnia o końcowym stężeniu 2 mM, którego dodatek zwiększał wydajność adsorpcji cząstek fagowych do komórek szczepu Serratia sp. OS10. Po uzyskaniu OD 600 = 0,5 przenoszono 9,9 ml odmłodzonej hodowli do kolby adsorpcyjnej. Do kolby adsorpcyjnej dodawano 0,1 ml zawiesiny fagowej o mianie 107 PFU/ml, jednocześnie zaczynając mierzenie czasu. Mieszaninę inkubowano w wytrząsarce w temperaturze 20 °C. Po 5 minutach przenoszono 0,1 ml zawartości z kolby adsorpcyjnej do „kolby A” zawierającej 9,9 ml pożywki płynnej LB, której zawartość następnie inkubowano w temperaturze 20 °C z wytrząsaniem (kolba A stanowiła jednocześnie odmłodzenie hodowli oraz 100-krotne rozcieńczenie mieszaniny z kolby adsorpcyjnej). Po upływie 5 minut
pobierano z „kolby A” mieszaninę w ilości: (i) 1 ml do probówki opisanej literą „K” zawierającej 50 µl chloroformu[1]; (ii) 100 µl do probówki oznaczonej symbolem „A1” zawierającej 150 µl nocnej hodowli OS10 oraz po określeniu czasu latencji w następnych podejściach dodawano (iii) 1 ml do „kolby B” zawierającej 9,9 ml jałowej pożywki płynnej
LB (co stanowi 10-krotne rozcieńczenie zawartości kolby A). Zawartość probówki opisanej literą „K” mieszano przez około 1 min, po czym przechowywano w lodzie – preparat ten stanowił układ odniesienia, obrazujący ilość niezaadsorbowanych cząstek fagowych. Zawartość kolby B wytrząsano równolegle z wytrząsaniem kolby A, a po kolejnych 5 minutach 1 ml zawartości z kolby B przenoszono do kolby C zawierającej 9 ml jałowej pożywki LB. Do probówki z oznaczeniem „A1” po wymieszaniu i 5-minutowej inkubacji dodawano 4 ml agaru półpłynnego, mieszano i rozprowadzano po agarze dolnym na szalce podpisanej numerem seryjnym „A1” zgodnie z procedurą opisaną w Podrozdziale 4.1. Odstępy między kolejnymi pomiarami następowały zależnie od potrzeb – wynosiły od 5 do 15 minut. Każdy z pomiarów miał swój indywidualny numer seryjny składający się z litery oznaczającej kolbę oraz liczby porządkowej dla danego momentu pomiarowego (przy czym pomiary dla kolb A, B i C wykonane w tym samym momencie od infekcji w kolbie adsorpcyjnej miały ten sam numer i różniły się tylko literą). W pierwszym podejściu określano: czy czas latencji jest krótszy od 60 minut; w związku z czym wszystkie 12 pomiarów odbywało się tylko dla kolby A i między każdymi dwoma był odstęp czasowy 5 minut. W następnym podejściu wykonywano 19 pomiarów (pomiary A1-A5 wykonywane co 10 minut, a pomiary A5-A19 wykonywane co 5 minut). Po określeniu czasu latencji wykonywano kolejne powtórzenie, tym razem w odstępach 15-minutowych dla pomiarów A1-A6 oraz w odstępach 5-minutowych dla pomiarów A6-A14 i B8-B20. Celem wprowadzenia do doświadczenia kolby B było określenie, czy faza plateau ustala się w obrębie 10-krotnego rozcieńczenia hodowli z zachowaniem policzalności łysinek na szalce (z kolby B), czy dopiero w obrębie 100-krotnego rozcieńczenia hodowli (z kolby C). Po ustaleniu czasu latencji, tj. czasu, po którym nastąpił wysyp nowych cząstek infekcyjnych z zainfekowanych komórek gospodarza, postanowiono, że w następnym podejściu do eksperymentu, na około 10 minut przed przewidywanym wysypem, zbierane będą z kolby B próbki po 100 µl równolegle z dotychczas zbieranymi pomiarami z kolby A – dzięki czemu określano, po jakim czasie kończył się pierwszy wysyp i zachodziła faza drugiego plateau. Czwarte i piąte podejście przewidywały wykorzystanie 3 kolb: kolby A, kolby B i kolby C, dla których wiadomo było zarówno: ile wynosi czas latencji oraz jaki jest czas, w którym dojdzie do drugiego plateau (Rycina 16).
Podczas projektowania wykresu w oparciu o ilość łysinek mnożono ilość tych łysinek przez współczynnik (1000 µl/X)*10Y, gdzie X to objętość nakroplenia (tu 10 µl) lub objętość próbki badanej w teście pełnoszalkowym (tu 100 µl), zaś Y to rząd wielkości rozcieńczenia próbki względem zawartości kolby A. Wykres przedstawiano w formie diagramu punktowego. W późniejszym wariancie procedury odpowiednikiem kolejnych kolb były kolejne 10-krotne rozcieńczenia dla każdej próbki z kolby A.
Przypisy
- ↑ Rolą chloroformu było zabicie wszystkich komórek bakteryjnych w próbce. Skutkowało to wyeliminowaniem centrów infekcyjnych, które pochodzą z bakteriofagów zaadsorbowanych do komórek. Ewentualne łysinki powstałe na szalce z kontrolą mogły pochodzić jedynie z niezaadsorbowanych cząstek infekcyjnych. Ponieważ jednak cząstki fagowe składane w zainfekowanych komórkach są infekcyjne jeszcze zanim nastąpi rozpad komórki, pomiary prób kontrolnych wykonywano tylko dla pierwszych 15 minut eksperymentu.
Dodatkowe informacje o autorach i źródle znajdują się na stronie dyskusji.