Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Metody/Przygotowanie komórek kompetentnych metodą rubidowo-wapniową

4.11 Przygotowanie komórek kompetentnych metodą rubidowo-wapniową

 Na dzień przed właściwą procedurą, przygotowano nocną hodowlę poprzez zawieszenie czystej kultury z posiewu redukcyjnego szczepu E. coli TOP 10 F’ w 3 ml jałowego podłoża płynnego LB z późniejszym inkubowaniem tej hodowli przez około 21 godzin w wytrząsarce z ustawioną temperaturą 37 °C i szybkością wytrząsania 100 rpm. Nocną hodowlę E. coli TOP 10 F’ (Podrozdział 3.2) odmładzano, przenosząc 1 ml hodowli do 50 ml płynnego podłoża LB o temperaturze 37 °C. Hodowlę prowadzono aż do osiągnięcia OD₆₀₀ około 0,4. Kolbę z odmładzaną hodowlą inkubowano w lodzie przez 30 min. Zawartość kolby przenoszono do probówek wirowniczych i wirowano z prędkością 3700 rpm w temperaturze 4 °C przez 10 min. Supernatant usuwano, osad zawieszano w 1 ml buforu TFB I (Podrozdział 3.5.3), próbki dopełniano buforem TFB I do końcowej objętości 33 ml. Próbki mieszano poprzez odwracanie, inkubowano w lodzie przez 20 min i wirowano z prędkością 3500 rpm w temperaturze 4 °C przez 10 min. Supernatant usuwano, osad zawieszano w 3 ml buforu TFB II (Podrozdział 3.5.3). Próbki utrzymywano w temperaturze lodu podczas przenoszenia do nowych probówek w porcjach po 100 µl i zamrażano w temperaturze -80 °C.