Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Metody/Reakcja PCR

4.14 Reakcja PCR

 Wykonywano pomiar stężenia matrycy dla badanej próbki. W oparciu o pomiar wyliczano potrzebną ilość matrycy, którą następnie dodawano do mieszaniny reakcyjnej (objętość matrycy dostarczająca plazmidowy albo wirusowy DNA do mieszaniny reakcyjnej w ilości od 1 pg do 10 ng). Reakcję przeprowadzano według programu termocyklera (Tabela 6).

Tabela 6. Warunki reakcji PCR przeprowadzanych w niniejszej pracy.

Etap		Temperatura	Czas
Denaturacja wstępna		98 °C	30 sek
35 cyklów	Denaturacja	98 °C	10 sek
	Hybrydyzacja startera	64 °C	30 sek
	Elongacja	72 °C	30 sek
Elongacja uzupełniająca		72 °C	3 min
Zatrzymanie		4 °C	∞

Buforem stosowanym do reakcji PCR był bufor HF (ang. High Fidelity) (Podrozdział 3.6). Enzymem stosowanym do reakcji PCR była polimeraza DNA Phusion (Podrozdział 3.6). Skład mieszaniny oraz kolejność dodawania komponentów przedstawia Tabela 7:

Tabela 7. Składniki reakcji PCR przeprowadzanych w niniejszej pracy.

kolejność	Składnik	Objętość	Końcowe stężenie
1	woda destylowana	dopełniająco do 50 µl
2	5X bufor Phusion HF	10 µl	1X
3	10 mM dNTP-y	1 µl	200 µM
4	10 µM starter Forward	2,5 µl	0,5 µM
5	10 µM starter Reverse	2,5 µl	0,5 µM
6	matryca DNA	zmiennie	1 pg – 10 ng
7	polimeraza DNA Phusion	0,5 µl	1U

Polimerazę DNA dodawano tuż przed umieszczeniem próbek w termocyklerze. Po zakończeniu programu wykonywano kontrolę poprzez nałożenie na żel agarozowy około 10 µl produktu PCR wraz z miarką molekularną i wykonywanie elektroforezy – obecność prążka na przewidywanej wysokości świadczyła o udanym wykonaniu procedury.