Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Wstęp/Opis cyklu infekcyjnego bakteriofagów z rzędu Caudovirales

1.4 Opis cyklu infekcyjnego bakteriofagów z rzędu Caudovirales

 Bakteriofagi z rzędu Caudovirales, podobnie do innych wirusów, są obligatoryjnymi pasożytami i mogą się namnażać tylko wewnątrz komórek swojego gospodarza. Pierwszym etapem cyklu infekcyjnego (nie tylko Caudovirales, ale wszystkich wirusów) jest adsorpcja. Zachodzi ona dzięki specyficzności receptorów zlokalizowanych na końcu ogonka bakteriofaga – np. fagowego białka wiążącego (ang. receptor binding protein, RBP) [Bielmann i in., 2015]. Dopóki adhezja wirusa do komórki nie spowoduje w wirionie zmian konformacyjnych, mówi się o adsorpcji odwracalnej, podczas której oddysocjowanie cząstki wirusowej nie skutkuje utratą jej funkcjonalności. Dopiero gdy receptory bakteriofaga rozpoznają odpowiednie epitopy gospodarza (np. lipopolisacharyd lub białko LamB [Kemp i in., 2005; Rakhuba i in., 2010]), dochodzi do indukcji sygnału i jego propagacji przez białka ogonka powodując zmiany konformacyjne w wirionie. Zmiany te prowadzą do penetracji ściany komórkowej bakterii i wyrzutu DNA genomowego wirusa. Powoduje to, że adsorpcja bakteriofaga do komórki staje się nieodwracalna (mechaniczne usunięcie cząstki wirusowej z powierzchni komórki powoduje utratę infekcyjności) [Molineux, 2001]. Wiele bakteriofagów podczas adsorpcji wymaga obecności jonów dwuwartościowych: w przypadku bakteriofaga P1 są to jony Ca²⁺ [Walker i in., 1970], zaś w przypadku bakteriofaga λ są to jony Mg²⁺ [Schwartz, 1976]. Penetracja ściany komórkowej bakterii zachodzi z udziałem różnych mechanizmów w zależności od bakteriofaga:

• w przypadku Siphoviridae może się to odbywać za sprawą translokacji genomu przez naturalnie występujące kanały w strukturze błon komórkowych (np. przez białko LamB [Charbit i in., 1984; Xu & Xiang, 2017]),
• w przypadku Myoviridae może się to odbywać za sprawą mechanicznego przebicia ściany komórkowej przez rdzeń ogonka, który wysuwa się z pochewki wraz z jej kurczeniem się (dochodzi też to enzymatycznej degradacji ścian przez domenę katalityczną na końcu rdzenia, np. przez białko gp5 degradujące peptydoglikan [Xu & Xiang, 2017]),
• w przypadku Podoviridae (których ogonek jest zbyt krótki, aby przebić się przez ścianę komórkową bakterii) może się to odbywać za sprawą enzymatycznej degradacji peptydoglikanu oraz wbudowywania białek tworzących kanał centralny w miejscu zdegradowanej ściany komórkowej [Chang i in., 2010].

 U Caudovirales jedynym elementem wprowadzanym do komórki gospodarza jest genom wirusa. Pozostałe elementy (takie jak kapsyd) pozostają na zewnątrz komórki i nie biorą udziału w dalszych etapach infekcji [Rakhuba i in., 2010]. Po wniknięciu genomu fagowego do cytoplazmy gospodarza dochodzi do ekspresji genów, które nazywane są wczesnymi. Białka będące produktami tych genów są związane m. in. z obroną przed mechanizmami antyfagowymi (np. systemy anty-CRISPR [Pawluk i in., 2016]), decyzją liza/lizogenia [Erez i in., 2017] oraz replikacją [Taylor & Węgrzyn, 1995]. Przykładem białka będącego produktem genów wczesnych jest polimeraza RNA faga T7, specyficzna względem promotorów w genomie fagowym – z jej udziałem dochodzi do transkrypcji pozostałych genów [Shin i in., 2012]. Kolejnym etapem cyklu infekcyjnego jest replikacja genomu fagowego, która u niektórych fagów zachodzi po zamknięciu genomu w strukturę kolistą (np. u λ [Taylor & Węgrzyn, 1995]) – pierwsze rundy replikacyjne zachodzą zgodnie z modelem θ [Taylor & Węgrzyn, 1995], zaś po pierwszym cięciu genomu z udziałem terminazy dalsza replikacja zachodzi zgodnie [Taylor & Węgrzyn, 1995], co z modelem prowadzi do toczącego utworzenia się koła struktury (modelu σ) konkatameru [Casjens & Hayden, 1988] (tj. wielokrotnych kopii genomu połączonych szeregowo w tej samej orientacji [Bernstein & Bernstein, 1973]). Etap ten u niektórych bakteriofagów jest przeprowadzany przez produkty genów średnich. Jeśli w cyklu infekcyjnym danego bakteriofaga nie wyróżnia się genów średnich, replikacja przeprowadzana jest przez geny wczesne (co ma miejsce np. u bakteriofaga φ29 infekującego bakterie z rodzaju Bacillus sp. [Murray & Rabinowitz, 1982]). Po replikacji DNA wirusa dochodzi do ekspresji genów późnych – czyli przede wszystkim białek strukturalnych, niezbędnych do budowy główki, ogonka oraz innych elementów kapsydu. Są to białka, które po osiągnięciu odpowiedniej konformacji i stężenia w komórce podlegają samozłożeniu (ang. self-assembly) w strukturę przejściową zwaną „prokapsydem” – złożoną na zewnątrz z białek płaszcza (ang. coat protein, CP) tworzących główkę [Cerritelli i in., 2003]; zaś wewnątrz z białek rusztowania, które nadają prokapsydowi właściwą strukturę przestrzenną oraz białka portalowego, przez które genom fagowy będzie translokowany do główki [Lebedev i in., 2007]. Odbywa się to z udziałem kompleksu terminazy, której mała podjednostka rozpoznaje sekwencję cos (ang. cohesive end site) lub pac (ang. package); zaś duża podjednostka terminazy dokonuje nukleolitycznego cięcia DNA w sekwencji rozpoznanej przez małą podjednostkę terminazy i przeprowadza translokację DNA do prokapsydu [Fujisawa & Morita, 1997]. Sekwencje cos to sekwencje, w których od produktu replikacji w formie konkatameru następuje odcinanie monomerycznych cząsteczek genomu podczas pakowania go do prokapsydu przez terminazę [Shinder & Gold, 1988]. Sekwencję cos mają m.in. bakteriofag λ [Shinder & Gold, 1988] oraz bakteriofag HP1 [Fitzmaurice i in., 1984]. W innej sytuacji – gdy cięcie nie zachodzi w stałym miejscu, liniowe genomy fagów są koliście permutowane. To znaczy, że są produktami linearyzacji identycznych kolistych cząsteczek, powstałymi poprzez przecięcie ich w różnych miejscach. W przypadku niektórych fagów pierwsze cięcie, konkatamerycznej formy replikowanego genomu z udziałem terminazy, odbywa się w sekwencji pac [Vogel & Schmieger, 1986]. Mechanizm pakowania, w którym terminaza przeprowadza cięcie w dowolnym miejscu konkatameru (albo w miejscu pac) nazywany jest mechanizmem „head-full”, czyli takim gdzie najważniejszym czynnikiem limitującym ilość zapakowanego DNA jest pojemność główki (terminaza odcina genom, gdy dalsze pakowanie go do główki jest fizycznie niemożliwe). Przykładami bakteriofagów replikujących się z udziałem tego systemu są m.in. bakteriofag P22 [Moore & Prevelige, 2002; Tang i in., 2011] oraz SP16 [Parker & Dean, 1986]. O ile w przypadku pakowania typu „head-full” czynnikiem limitującym ilość zapakowanego genomu jest pojemność kapsydu, to u bakteriofagów z genomem pakowanym według mechanizmu bazującego na sekwencjach cos kapsyd też jest w pełni wypełniony (zależy to jednak od długości genomu ograniczonej sekwencjami cos, a nie od pojemności kapsydu per se) [Lin & Black, 1998]. U bakteriofagów z genomem pakowanym według mechanizmu „head-full” materiał genetyczny pakowany jest z nadmiarem sięgającym nawet 10% genomu [Fokine i in., 2014]. W trakcie translokacji genomu do prokapsydu następuje rearanżacja cząstki wirusowej, białka rusztowania ulegają degradacji, a miejsce po tych białkach wypełnia genom. Jako ostatnie z genów późnych są wyrażane geny z modułu litycznego, do których zaliczamy: holiny (białka tworzące dziury w błonie cytoplazmatycznej, co zapewnia obecnej w cytoplazmie endolizynie dostęp do peptydoglikanu) oraz endolizyny (hydrolazy degradujące peptydoglikan, co prowadzi do perforacji ściany komórkowej). Efektem aktywności holin i endolizyn jest uwolnienie potomnych cząstek bakteriofagowych. Ponieważ liza przerywa wszystkie procesy zachodzące w komórce, ma ona miejsce dopiero, gdy zakończą się wszystkie wcześniejsze etapy cyklu infekcyjnego [Loessner, 2005]. Jak wspomniano na początku Podrozdziału 1.3, geny fagowe tworzą moduły funkcjonalne, przy czym kolejność etapów cyklu infekcyjnego niekoniecznie jest odzwierciedlona przez kolejność modułów (Rycinie 8). Kolinearność pewnych genów w module stanowi cenną wskazówkę w przewidywaniu funkcji białek hipotetycznych, tj. takich których sekwencję aminokwasową ustalono na drodze analizy genomicznej, ale których funkcji nie da się przewidzieć na podstawie podobieństwa do białek scharakteryzowanych eksperymentalnie (Podrozdział 1.6). Białka uczestniczące w tym samym procesie muszą być eksprymowane na tym samym etapie cyklu infekcyjnego, więc geny je kodujące występują obok siebie.

Rycina 8. Mapa genomu bakteriofaga ES18. Pierwszy gen na nici wiodącej koduje małą podjednostkę terminazy. Kolejność genów tym przypadku nie koresponduje z kolejnością etapów cyklu infekcyjnego (lewe ramię rozpoczyna się od genów strukturalnych). Na nici wiodącej obecne są geny związane z cyklem litycznym, na nici opóźnionej obecne są geny związane z cyklem lizogennym [Casjens i in., 2005, zmienione].