Przejdź do zawartości

Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Wstęp

Z Wikibooks, biblioteki wolnych podręczników.

Wirusy to jednostki biologiczne reprodukujące się w komórkach organizmów żywych. Ich istnienie jest nierozłącznie związane z infekowanym organizmem (gospodarzem). Przyjmuje się, że każdy organizm może ulec infekcji wirusowej [Baj, 2018]. Są one obligatoryjnymi pasożytami aparatu translacyjnego – nie posiadają własnych rybosomów, więc w produkcji ich białek zawsze uczestniczą rybosomy gospodarza [Mohr i in., 2007]. W budowie wszystkich wirusów wyróżnić można cząsteczkę genomową w postaci jednoniciowego lub dwuniciowego kwasu deoksyrybonukleinowego (ang. deoxyribonucleic acid, DNA) kolistego lub liniowego lub kwasu rybonukleinowego (ang. ribonucleic acid, RNA) jednoniciowego, dwuniciowego, albo dwuniciowego segmentowanego (Rycina 1). U większości wirusów genom osłonięty jest białkowym kapsydem (niektóre wirusy grzybowe utraciły geny kodujące białka kapsydu), zaś niektóre z wirusów posiadających kapsyd zawierają też osłonkę lipidową. Kapsydy wirusów mogą mieć różną strukturę, jej najpowszechniejszymi formami są: struktura ikozaedralna, helikalna i złożona (Ryciny 2 i 3).

Rycina 1. Genomy wirusów DNA i RNA [Collier & Oxford, 2001].
Rycina 2. Budowa cząstki wirusowej [na podstawie: Baj, 2018].

Rycina 3. Wirus o budowie helikalnej [viralzone.expasy.org, 2019, zmienione].

Nie ulega wątpliwości, iż wirusy w znaczący sposób wpływają na ewolucję życia na Ziemi. Dzieje się tak, gdyż między wirusami a ich gospodarzami ma miejsce nieustanny wyścig zbrojeń oraz ze względu na fakt, że wirusy są jednym z czynników horyzontalnego transferu genów, co wyjaśniono w dalszych rozdziałach pracy. Wspomniany powyżej wyścig zbrojeń jest zjawiskiem polegającym na ciągłych zmianach zachodzących zarówno u wirusa, jak i u infekowanego przez niego gospodarza: presja selekcyjna powoduje osiąganie większego sukcesu reprodukcyjnego przez gospodarza z takimi mutacjami, za sprawą których jego nowy fenotyp utrudnia lub wręcz uniemożliwia przeprowadzenie pełnego cyklu infekcyjnego przez infekujące go wirusy. W odpowiedzi na zmiany fenotypu gospodarza (wynikające ze zmian w jego genotypie), presja selekcyjna promuje wirusy z takimi mutacjami, które umożliwiają przełamanie bariery w postaci nowo uzyskanej cechy u komórek gospodarza. Proces ten zachodzi jednocześnie i u gospodarza, i u wirusa, powodując ich wzajemną koewolucję [Stern & Sorek, 2011].
Odkrycie wirusów miało miejsce w 1892 roku. Dokonał go rosyjski naukowiec Dmitri Ivanovski, który zauważył że znajdujący się w wodzie czynnik wywołujący zmiany chorobowe u roślin przenika przez porcelanowe filtry (o rozmiarach porów zatrzymujących bakterie) [Wilson, 2014]. Podobne badanie wykonał Martinus Beijerinck, który w trakcie badań choroby mozaiki tytoniu w 1889 zauważył ścisły związek między kontaktem zdrowych roślin z ekstraktem komórkowym roślin wykazujących zmiany chorobowe, a pojawieniem się u nich objawów chorobowych. Ekstrakt komórkowy zachowywał w sobie czynnik wirulentny nawet po przesączeniu go przez filtry Chamberlanda, (za pomocą których z cieczy usuwano komórki bakteryjne). Czynnik ten określił mianem ”virus“ (łac. jad, trucizna) [Creager, 1999]. Od tego czasu dynamicznie prowadzono kolejne badania nad wirusami. W roku 1898 badacze Loffler oraz Frosch dokonali pierwszego odkrycia wirusa zwierzęcego, wywołującego pryszczycę (ang. foot-and-mouth disease) [Loeffler & Frosch, 1898] oraz opracowali koncepcję wirusa jako czynnika chorobotwórczego, wedle której wirus jest nie tylko małą cząstką, ale wymaga wejścia do komórki gospodarza, by w niej się namnożyć (samo umieszczenie wirusa w pożywce nie wystarczy do namnożenia go) [Loeffler & Frosch, 1898]. W ciągu 2 lat od tego wydarzenia nastąpiło pierwsze odkrycie wirusa ludzkiego, którym był wirus żółtej febry. Odkrył go w roku 1901 amerykański chirurg Walter Reed [Reed i in., 1901]. Kolejnym odkrytym wirusem ludzkim był wirus ospy prawdziwej (ang. variola virus), zobrazowany w 1906 roku przez Enrique Paschen’a poprzez barwienie fuksyną [Fenner i in., 1988; Paschen, 1906]. Dekadę później odkryto wirusy bakteryjne, czego dokonali niezależnie w roku 1915 Fryderyk Twort – brytyjski lekarz i naukowiec badający zjawisko lizy komórek Vibrio cholerae po kontakcie z próbkami wód Gangesu [Twort, 1915] oraz w roku 1917 Feliks d’Herrele – francuski mikrobiolog i pomysłodawca terapii fagowej[1], badający czynniki zapobiegające dyzenterii [d’Herelle, 1917; Vandamme i in., 2019]. Termin „bakteriofag” zaproponowany przez Feliksa d’Herelle pochodzi od dwóch słów: łacińskiego „bacteria” oraz greckiego „φαγεῖν” (phagein) oznaczającego „pożerać”. Nazwa ta wynika z widocznych gołym okiem skutków infekcji wirusowej, czyli przezroczystych przejaśnień na murawce bakterii zwanych „łysinkami” (fr. plaques), wyglądających jakby w tych miejscach pewien drobnoustrój był zdolny do spożywania komórek bakteryjnych [d’Herelle, 1917].

Bakteriofagi są najliczniejszymi jednostkami biologicznymi na Ziemi. Szacuje się, że ich całkowita liczebność sięga wartości 1031 [Suttle, 2005; Wommack i in., 2000]. Szacuje się też, że średnio w każdym mililitrze wody oceanicznej znajduje się od 107 do 108 cząstek wirusowych, zaś w glebie ich liczebność wynosi w przybliżeniu 2,7 * 108 cząstek/g [Fortier & Sekulovic, 2013; Srinivasian i in., 2008; Weinbauer, 2004]. Liczby te są wartościami uśrednionymi. Faktyczne zagęszczenie populacji bakteriofagów w danej niszy uwarunkowane jest wieloma czynnikami środowiskowymi w zestawieniu z zakresem tolerancji danego wirusa na te czynniki, np. temperatura otoczenia versus zakres tolerancji temperaturowej bakteriofaga [Fortier & Sekulovic, 2013; Weinbauer, 2004]. Bakteriofagi pośrednio, ale w znaczący sposób wpływają na obieg pierwiastków w przyrodzie: liza komórek bakteryjnych pod koniec cyklu litycznego bakteriofaga skutkuje uwolnieniem cytoplazmy bakterii do środowiska, a wraz z nią wszystkich zawartych w niej substancji. Skala tego zjawiska, wynikająca z liczby bakteriofagów na świecie, oraz częstości infekcji (w ciągu doby dochodzi do około 1029 infekcji bakteriofagami), przekłada się na istotną rolę bakteriofagów w przepływie energii i wszystkich pierwiastków w przyrodzie [Abedon, 2001]. Ponadto bakteriofagi mają też wpływ na inne procesy biologiczne, do których zaliczamy: utrzymywanie bioróżnorodności i równowagi ilościowej między populacjami bakteryjnymi [Fortuna i in., 2019] oraz horyzontalny transfer genów [Davidson, 2018].

Przez klasyfikację wirusów rozumie się ich przyporządkowanie do właściwych taksonów. Instytucją koordynującą klasyfikację oraz nomenklaturę wirusów jest ustanowiony w roku 1966 Międzynarodowy Komitet Taksonomii Wirusów (ICTV, ang. International Comittee in Nomenclature of Viruses), który aktualizuje taksonomię wirusów w postaci raportów [https://talk.ictvonline.org]. Podstawowe kryteria klasyfikacji wirusów wymieniono w Tabeli 1.

Tabela 1. Podstawowe kryteria klasyfikacji ICTV [na podstawie: Baron, 1996; Guttman, 2001; Zhang i in., 2019].
Cecha Warianty
rodzaj kwasu nukleinowego DNA
RNA
topologia cząsteczki kwasu nukleinowego kolista – c (ang. circular)
liniowa – l (ang. linear)
polarność genomu (tylko dla ssRNA) (+) dodatnia – genomowy RNA może być wykorzystany jako mRNA do syntezy białek w procesie translacji
(–) ujemna – genomowy RNA nie może służyć jako matryca w translacji, bo jest komplementarny do wirusowego mRNA
ilość segmentów w genomie genom jednosegmentowy
genom wielosegmentowy
symetria nukleokapsydu ikozaedralna
helikalna
złożona
pleomorficzna
brak kapsydu
rozmiar wirionu i kapsydu
występowanie osłonki lipidowej obecność osłonki
brak osłonki

Kryteria wymienione w Tabeli 1 nie wyczerpują listy pozostałych cech, które brane są pod uwagę przy ustanawianiu nowych taksonów. Uwzględnia się również wiele innych cech dotyczących między innymi: właściwości fizykochemicznych wirionów, białek wirusowych, lipidów, węglowodanów, antygenów i tropizmu do tkanek [Frederik i in., 2012]. Z historycznego punktu widzenia klasyfikacja wirusów cechuje się dużym dynamizmem – kryteria klasyfikacji wielokrotnie się zmieniały na przestrzeni dekad i z początku uwzględniały jedynie: zakres gospodarzy, cykl replikacyjny i strukturę wirionów (gdyż tylko na to pozwalały ówczesne techniki badawcze). Dalsze uściślanie taksonomii stało się możliwe dzięki genomice (tj. analityki genomów), metagenomice (tj. analityki materiału genetycznego izolowanego z różnych nisz ekologicznych) i analizom porównawczym. Genomika istotnie poszerzyła możliwości klasyfikowania wirusów, gdyż pozwoliła na włączenie informacji dotyczących sekwencji ich materiału genetycznego. Dzięki analizom porównawczym stało się możliwe odkrywanie zależności filogenetycznych między poznanymi wirusami, czego nie udałoby się zrobić w oparciu o sam fenotyp [Edwards & Rohwer, 2005]. Wraz z rozwojem metagenomiki z powodzeniem zainicjowano również badania wirusów niedających się hodować klasycznymi metodami laboratoryjnymi, albo których gospodarze nie byli znani [Edwards & Rohwer, 2005]. Nazwy taksonomiczne wpisują się w ściśle określony schemat, ich końcówki gramatyczne (tzw. sufiksy) wskazują na rangę taksonomiczną danej grupy. Nowością w świecie nauki jest rozbudowanie taksonomii wirusów o jednostki wyższe niż rząd, tj.: klasy, podtypy i typy [ICTV, 2018a] oraz królestwa [ICTV, 2018b]. Ze względu na dużą różnorodność nie wszystkie wirusy są przyporządkowane do taksonów wyższego stopnia – nie wszystkie rodzaje są przyporządkowane do podrodziny albo wręcz rodziny; zaś nie wszystkie rodziny są przyporządkowane do określonego rzędu (analogicznie względem wyższych taksonów). Obecnie obowiązujący podział taksonomiczny bakteriofagów wyróżnia 14 rodzin, z czego tylko 5 rodzin jest przypisanych do rzędu (Caudovirales) – w tym dwie nowe rodziny: Ackermannviridae i Herelleviridae ustanowione przez ICTV w roku 2018 [ICTV, 2018b]. Rodziny Cystoviridae oraz Leviviridae, są przyporządkowane bezpośrednio do nowo ustanowionej rangi taksonomicznej realm (która jest odpowiednikiem królestwa albo domeny) Riboviria [talk.ictvonline.org/taxonomy, dostęp: 01.09.2019]. Zestawienie dotychczas wyłonionych grup taksonomicznych bakteriofagów zawarto w Tabeli 2; analiza zawartych w niej danych prowadzi do wniosku, iż: najpowszechniejszym typem genomu u bakteriofagów jest dsDNA, w drugiej kolejności ssDNA, a najrzadszym wariantem jest RNA.

Tabela 2. Wykaz rodzin bakteriofagów z wymienionymi cechami charakterystycznymi i przykładowymi przedstawicielami, uzupełniony o rodziny Ackermannviridae i Herelleviridae. (L) to genom liniowy, (C) to genom kolisty, (S) to genom segementowany. [na podstawie: Mc Grath S & van Sinderen D, 2007; Krupovic i in., 2011; Barylski i in., 2018; Kropinski i in., 2018; talk.ictvonline.org/taxonomy, dostęp: 01.09.2019].
Rząd Rodziny Typ genomu Opis Przedstawiciel
Caudovirales Ackermannviridae dsDNA,
L
  • bezosłonkowe
  • z długim, kurczliwym ogonkiem
φMAM1
Herelleviridae dsDNA,
L
  • bezosłonkowe
  • z długim ogonkiem
A9
Myoviridae dsDNA,
L
  • bezosłonkowe
  • z długim, kurczliwym ogonkiem
T4
Siphoviridae dsDNA,
L
  • bezosłonkowe
  • z długim, niekurczliwym ogonkiem
λ
Podoviridae dsDNA,
L
  • bezosłonkowe
  • z krótkim niekurczliwym ogonkiem
T7
niesklasyfikowane Corticoviridae dsDNA,
C
  • bezosłonkowe
  • kształt ikozaedralny
PM2
Plasmaviridae dsDNA,
C
  • osłonkowe
  • o kształcie pleomorficznym
L2
Sphaerolipoviridae dsDNA,
C
  • bezosłonkowe
  • kształt ikozaedralny
  • pęcherzyk błonowy zamknięty w kapsydzie
Thermus virus P23-77
Tectiviridae dsDNA,
L
  • bezosłonkowe
  • o kształcie ikozaedralnym
PRD1
Inoviridae ssDNA,
C
  • bezosłonkowe
  • o filamentowym kształcie
M13
Microviridae ssDNA,
C
  • bezosłonkowe
  • o kształcie ikozaedralnym
ΦX174
Cystoviridae dsRNA,
L, S
  • osłonkowe
  • kształt sferyczny
φ6
Leviviridae (+)ssRNA,
L
  • bezosłonkowe
  • o kształcie ikozaedralnym


Bakteriofagi z rzędu Caudovirales mają budowę złożoną (Ryciny 4,5,6). Ich kapsydy składają się z ikozaedralnej główki i ogonka, który zakończony może być płytką podstawową (ang. baseplate), włókienkami lub kolcami umożliwiającymi adhezję do komórek gospodarza. W zależności od rodziny ogonek może być długi i niekurczliwy (Siphoviridae), długi i kurczliwy (Myoviridae, Ackermannviridae, Herelleviridae) albo krótki i niekurczliwy (Podoviridae). Cechą odróżniającą Ackermannviridae od Myoviridae jest brak kołnierza pomiędzy główką, a ogonem [Kropinski i in., 2018]. Kryterium, wedle którego wyłączono niektórych przedstawicieli z Myoviridae i przeniesiono do nowo ustanowionej rodziny Herelleviridae, było podobieństwo sekwencji nukleotydowych tychże wirusów na poziomie 95% [Barylski i in., 2018]. Efektem tej zmiany było przeniesienie 18 gatunków z rodziny Myoviridae do rodziny Herelleviridae [Barylski i in., 2018]. Niestety wiele programów bioinformatycznych, m. in. Virfam (Podrozdział 1.6.5), nie zostało jeszcze zaktualizowanych pod kątem rodzin Ackermannviridae i Herelleviridae, w związku z tym nowo odkrywane bakteriofagi, które przypuszczalnie mogłyby być klasyfikowane do tych rodzin, przez dostępne (i nie uaktualnione) programy bioinformatyczne są wciąż przypisywane do rodziny Myoviridae.

Rycina 4. Budowa wirionów Siphoviridae [viralzone.org, 2019, zmienione].
Rycina 5. Budowa wirionów Myoviridae [viralzone.org, 2019, zmienione].
Rycina 6. Budowa wirionów Podoviridae [viralzone.org, 2019, zmienione].

Budowa modularna wiąże się z pojęciem "modułu funkcjonalnego" – tj. zgrupowania genów pod kontrolą wspólnego promotora, których produkty zazwyczaj biorą udział w tym samym procesie. Do funkcjonalnych modułów należą zgrupowania genów zaangażowanych np. w replikację, w morfogenezę kapsydu czy lizę komórki gospodarza. Na poniższej rycinie przedstawiono przykładowe struktury genomów fagowych z wyszczególnionymi modułami funkcjonalnymi (Rycina 7). Cechą właściwą genomów bakteriofagowych jest ich mozaikowość, co oznacza, iż genom bakteriofaga można postrzegać jako unikatową kombinację segmentów DNA, które zostały nabyte przez horyzontalną wymianę genetyczną i mogą być wymieniane między populacjami różnych (nawet odległych ewolucyjnie) bakteriofagów.

Rycina 7. Mozaikowość genomów wśród bakteriofagów ogonkowych na przykładzie bakteriofagów: N15, λ, HK97, SfV oraz Mu. Geny homologiczne przedstawiono w jednolitej kolorystyce; skośne paski w kolorystyce genów oznaczają, iż produkty białkowe tych genów pełnią analogiczną funkcję. [Lawrence i in., 2002 zmienione].

Bakteriofagi z rzędu Caudovirales, podobnie do innych wirusów, są obligatoryjnymi pasożytami i mogą się namnażać tylko wewnątrz komórek swojego gospodarza. Pierwszym etapem cyklu infekcyjnego (nie tylko Caudovirales, ale wszystkich wirusów) jest adsorpcja. Zachodzi ona dzięki specyficzności receptorów zlokalizowanych na końcu ogonka bakteriofaga – np. fagowego białka wiążącego (ang. receptor binding protein, RBP) [Bielmann i in., 2015]. Dopóki adhezja wirusa do komórki nie spowoduje w wirionie zmian konformacyjnych, mówi się o adsorpcji odwracalnej, podczas której oddysocjowanie cząstki wirusowej nie skutkuje utratą jej funkcjonalności. Dopiero gdy receptory bakteriofaga rozpoznają odpowiednie epitopy gospodarza (np. lipopolisacharyd lub białko LamB [Kemp i in., 2005; Rakhuba i in., 2010]), dochodzi do indukcji sygnału i jego propagacji przez białka ogonka powodując zmiany konformacyjne w wirionie. Zmiany te prowadzą do penetracji ściany komórkowej bakterii i wyrzutu DNA genomowego wirusa. Powoduje to, że adsorpcja bakteriofaga do komórki staje się nieodwracalna (mechaniczne usunięcie cząstki wirusowej z powierzchni komórki powoduje utratę infekcyjności) [Molineux, 2001]. Wiele bakteriofagów podczas adsorpcji wymaga obecności jonów dwuwartościowych: w przypadku bakteriofaga P1 są to jony Ca2+ [Walker i in., 1970], zaś w przypadku bakteriofaga λ są to jony Mg2+ [Schwartz, 1976]. Penetracja ściany komórkowej bakterii zachodzi z udziałem różnych mechanizmów w zależności od bakteriofaga:

  • w przypadku Siphoviridae może się to odbywać za sprawą translokacji genomu przez naturalnie występujące kanały w strukturze błon komórkowych (np. przez białko LamB [Charbit i in., 1984; Xu & Xiang, 2017]),
  • w przypadku Myoviridae może się to odbywać za sprawą mechanicznego przebicia ściany komórkowej przez rdzeń ogonka, który wysuwa się z pochewki wraz z jej kurczeniem się (dochodzi też to enzymatycznej degradacji ścian przez domenę katalityczną na końcu rdzenia, np. przez białko gp5 degradujące peptydoglikan [Xu & Xiang, 2017]),
  • w przypadku Podoviridae (których ogonek jest zbyt krótki, aby przebić się przez ścianę komórkową bakterii) może się to odbywać za sprawą enzymatycznej degradacji peptydoglikanu oraz wbudowywania białek tworzących kanał centralny w miejscu zdegradowanej ściany komórkowej [Chang i in., 2010].

U Caudovirales jedynym elementem wprowadzanym do komórki gospodarza jest genom wirusa. Pozostałe elementy (takie jak kapsyd) pozostają na zewnątrz komórki i nie biorą udziału w dalszych etapach infekcji [Rakhuba i in., 2010]. Po wniknięciu genomu fagowego do cytoplazmy gospodarza dochodzi do ekspresji genów, które nazywane są wczesnymi. Białka będące produktami tych genów są związane m. in. z obroną przed mechanizmami antyfagowymi (np. systemy anty-CRISPR [Pawluk i in., 2016]), decyzją liza/lizogenia [Erez i in., 2017] oraz replikacją [Taylor & Węgrzyn, 1995]. Przykładem białka będącego produktem genów wczesnych jest polimeraza RNA faga T7, specyficzna względem promotorów w genomie fagowym – z jej udziałem dochodzi do transkrypcji pozostałych genów [Shin i in., 2012]. Kolejnym etapem cyklu infekcyjnego jest replikacja genomu fagowego, która u niektórych fagów zachodzi po zamknięciu genomu w strukturę kolistą (np. u λ [Taylor & Węgrzyn, 1995]) – pierwsze rundy replikacyjne zachodzą zgodnie z modelem θ [Taylor & Węgrzyn, 1995], zaś po pierwszym cięciu genomu z udziałem terminazy dalsza replikacja zachodzi zgodnie [Taylor & Węgrzyn, 1995], co z modelem prowadzi do toczącego utworzenia się koła struktury (modelu σ) konkatameru [Casjens & Hayden, 1988] (tj. wielokrotnych kopii genomu połączonych szeregowo w tej samej orientacji [Bernstein & Bernstein, 1973]). Etap ten u niektórych bakteriofagów jest przeprowadzany przez produkty genów średnich. Jeśli w cyklu infekcyjnym danego bakteriofaga nie wyróżnia się genów średnich, replikacja przeprowadzana jest przez geny wczesne (co ma miejsce np. u bakteriofaga φ29 infekującego bakterie z rodzaju Bacillus sp. [Murray & Rabinowitz, 1982]). Po replikacji DNA wirusa dochodzi do ekspresji genów późnych – czyli przede wszystkim białek strukturalnych, niezbędnych do budowy główki, ogonka oraz innych elementów kapsydu. Są to białka, które po osiągnięciu odpowiedniej konformacji i stężenia w komórce podlegają samozłożeniu (ang. self-assembly) w strukturę przejściową zwaną „prokapsydem” – złożoną na zewnątrz z białek płaszcza (ang. coat protein, CP) tworzących główkę [Cerritelli i in., 2003]; zaś wewnątrz z białek rusztowania, które nadają prokapsydowi właściwą strukturę przestrzenną oraz białka portalowego, przez które genom fagowy będzie translokowany do główki [Lebedev i in., 2007]. Odbywa się to z udziałem kompleksu terminazy, której mała podjednostka rozpoznaje sekwencję cos (ang. cohesive end site) lub pac (ang. package); zaś duża podjednostka terminazy dokonuje nukleolitycznego cięcia DNA w sekwencji rozpoznanej przez małą podjednostkę terminazy i przeprowadza translokację DNA do prokapsydu [Fujisawa & Morita, 1997]. Sekwencje cos to sekwencje, w których od produktu replikacji w formie konkatameru następuje odcinanie monomerycznych cząsteczek genomu podczas pakowania go do prokapsydu przez terminazę [Shinder & Gold, 1988]. Sekwencję cos mają m.in. bakteriofag λ [Shinder & Gold, 1988] oraz bakteriofag HP1 [Fitzmaurice i in., 1984]. W innej sytuacji – gdy cięcie nie zachodzi w stałym miejscu, liniowe genomy fagów są koliście permutowane. To znaczy, że są produktami linearyzacji identycznych kolistych cząsteczek, powstałymi poprzez przecięcie ich w różnych miejscach. W przypadku niektórych fagów pierwsze cięcie, konkatamerycznej formy replikowanego genomu z udziałem terminazy, odbywa się w sekwencji pac [Vogel & Schmieger, 1986]. Mechanizm pakowania, w którym terminaza przeprowadza cięcie w dowolnym miejscu konkatameru (albo w miejscu pac) nazywany jest mechanizmem „head-full”, czyli takim gdzie najważniejszym czynnikiem limitującym ilość zapakowanego DNA jest pojemność główki (terminaza odcina genom, gdy dalsze pakowanie go do główki jest fizycznie niemożliwe). Przykładami bakteriofagów replikujących się z udziałem tego systemu są m.in. bakteriofag P22 [Moore & Prevelige, 2002; Tang i in., 2011] oraz SP16 [Parker & Dean, 1986]. O ile w przypadku pakowania typu „head-full” czynnikiem limitującym ilość zapakowanego genomu jest pojemność kapsydu, to u bakteriofagów z genomem pakowanym według mechanizmu bazującego na sekwencjach cos kapsyd też jest w pełni wypełniony (zależy to jednak od długości genomu ograniczonej sekwencjami cos, a nie od pojemności kapsydu per se) [Lin & Black, 1998]. U bakteriofagów z genomem pakowanym według mechanizmu „head-full” materiał genetyczny pakowany jest z nadmiarem sięgającym nawet 10% genomu [Fokine i in., 2014]. W trakcie translokacji genomu do prokapsydu następuje rearanżacja cząstki wirusowej, białka rusztowania ulegają degradacji, a miejsce po tych białkach wypełnia genom. Jako ostatnie z genów późnych są wyrażane geny z modułu litycznego, do których zaliczamy: holiny (białka tworzące dziury w błonie cytoplazmatycznej, co zapewnia obecnej w cytoplazmie endolizynie dostęp do peptydoglikanu) oraz endolizyny (hydrolazy degradujące peptydoglikan, co prowadzi do perforacji ściany komórkowej). Efektem aktywności holin i endolizyn jest uwolnienie potomnych cząstek bakteriofagowych. Ponieważ liza przerywa wszystkie procesy zachodzące w komórce, ma ona miejsce dopiero, gdy zakończą się wszystkie wcześniejsze etapy cyklu infekcyjnego [Loessner, 2005]. Jak wspomniano na początku Podrozdziału 1.3, geny fagowe tworzą moduły funkcjonalne, przy czym kolejność etapów cyklu infekcyjnego niekoniecznie jest odzwierciedlona przez kolejność modułów (Rycinie 8). Kolinearność pewnych genów w module stanowi cenną wskazówkę w przewidywaniu funkcji białek hipotetycznych, tj. takich których sekwencję aminokwasową ustalono na drodze analizy genomicznej, ale których funkcji nie da się przewidzieć na podstawie podobieństwa do białek scharakteryzowanych eksperymentalnie (Podrozdział 1.6). Białka uczestniczące w tym samym procesie muszą być eksprymowane na tym samym etapie cyklu infekcyjnego, więc geny je kodujące występują obok siebie.

Rycina 8. Mapa genomu bakteriofaga ES18. Pierwszy gen na nici wiodącej koduje małą podjednostkę terminazy. Kolejność genów tym przypadku nie koresponduje z kolejnością etapów cyklu infekcyjnego (lewe ramię rozpoczyna się od genów strukturalnych). Na nici wiodącej obecne są geny związane z cyklem litycznym, na nici opóźnionej obecne są geny związane z cyklem lizogennym [Casjens i in., 2005, zmienione].

Opisany w Podrozdziale 1.4 przebieg cyklu infekcyjnego jest uniwersalny dla wszystkich bakteriofagów – taka forma cyklu infekcyjnego zwie się „cyklem litycznym”, bo jej efektem końcowym jest liza komórki gospodarza. Jednakże w przypadku bardzo wielu bakteriofagów wytworzenie cząstek potomnych może być znacząco odsunięte w czasie w stosunku do momentu zainfekowania gospodarza. W tym okresie ich genomy pozostają w zakażonych komórkach jako formy latentne. W stanie utajenia ekspresja informacji genetycznej faga jest ograniczona tylko do genów, których produkty są odpowiedzialne za utrzymanie tego stanu (lizogenii) [Fortier & Sekulovic, 2013]. Genom faga w stanie latentnym może być wbudowany w bakteryjny chromosom albo pozostawać w cytoplazmie w formie episomu zdolnego do autonomicznej replikacji – zwanego profagiem plazmidopodobnym (ang. plasmid-like prophage) [Shen i in., 2018]. Analogicznie do plazmidów profagi plazmidopodobne mogą przyjmować formę kolistą (np. fag P1 [Cenens i in., 2013]) bądź liniową (np. fag xhp1 [Shen i in., 2018]). W cyklu lizogennym nie powstają cząstki potomne, ani nie dochodzi do lizy komórki. Bakteriofagi, zdolne do wejścia w cykl lizogenny nazywa się fagami lizogennymi lub fagami łagodnymi; zaś bakteriofagi niezdolne do tego nazywa się fagami wirulentnymi lub fagami zjadliwymi [Marsh & Wellington, 1994]. Cykl lityczny oraz cykl lizogenny zilustrowano na Rycinie 9. U fagów łagodnych decyzja molekularna pomiędzy wejściem w cykl lityczny lub lizogenny zależy od kondycji metabolicznej komórki oraz stosunku ilościowego cząstek fagowych do komórek gospodarza (MOI, ang. Multiplicity of Infection) – im więcej jest cząstek fagowych względem komórek gospodarza, tym większy odsetek infekujących cząstek fagowych wejdzie w stan lizogenii [Janion, 2008; Wei i in., 2001; Weinbauer, 2004].

Kolejnym etapem po penetracji wirusowego DNA jest zamknięcie go w kolistą cząsteczkę poprzez ligację albo rekombinację końców genomu. Układ genów w genomie fagowym (w kapsydzie) i w profagu (wintegrowanym do chromosomu bakteryjnego) jest różny. Zazwyczaj pierwszym genem lewego ramienia profaga jest gen integrazy (skr. int). W przypadku liniowych genomów fagów znajdujących się w kapsydach, które terminaza przecięła w miejscach cos, pierwszym genem lewego ramienia jest gen kodujący małą podjednostkę terminazy (skr. ter). Wyżej opisane warianty zilustrowano na Rycinie 10.

Rycina 10. Integracja genomu fagowego do chromosomu gospodarza: Liniowy genom wirusa (1) po znalezieniu się w cytoplazmie ulega cyrkularyzacji (2). Pomiędzy miejscem attP (ang. attachment of Phage) w kolistym genomie faga (3A), a miejscem attB (ang. attachment of Bacterium) w chromosomie gospodarza (3B) dochodzi do rekombinacji homologicznej (4). W efekcie kolisty genom faga staje się wstawką wbudowaną w chromosom gospodarza (5), zaś na granicy obu genomów powstają sekwencje attL (ang. attachment Left) i attR (ang. attachment Right), będące produktami rekombinacji miejsc attB i attP [na podstawie: Raya i in., 1992].

Jak wspomniano wcześniej – bakteriofaga łagodnego, który wszedł w stan lizogenii nazywa się profagiem, zaś szczep bakteryjny z wbudowanym do genomu fagiem nazywa się lizogenem. Cechą charakterystyczną szczepów lizogennych jest ich oporność na infekcję tym samym lub pokrewnym bakteriofagiem (tzw. zjawisko oporności na superinfekcję), co wynika w zależności od bakteriofaga: albo z obecności eksprymowanego białka represora kodowanego przez profaga (białko to powoduje blokadę ekspresji genów litycznych bakteriofaga-intruza [Susskind i in., 1974; Sun i in., 2006]); albo z syntezy białek kodowanych przez geny profaga, których funkcją jest blokowanie translokacji genomu bakteriofaga-intruza do cytoplazmy [Lu & Henning, 1994].

Wszystkie bakteriofagi; niezależnie czy zjadliwe, czy łagodne; mogą wejść w stan pseudolizogenii [Łoś & Węgrzyn, 2012]. Stan ten polega na zahamowaniu cyklu infekcyjnego wirusa. Jego materiał genetyczny pozostaje w cytoplazmie w formie episomalnej (liniowej lub kolistej), ale nie dochodzi do jego replikacji. W stanie pseudolizogenii żaden z genów bakteriofaga nie ulega ekspresji. Genom bakteriofaga w stanie pseudolizogenii jest przekazywany do komórek potomnych gospodarza losowo, a zatem pewne komórki potomne mogą otrzymać cytoplazmę pozbawioną wirusowego kwasu nukleinowego [Fortier & Sekulovic, 2013]. Stan pseudolizogenii jest odwracalny i stanowi przystosowanie bakteriofaga do skrajnie słabej kondycji metabolicznej zainfekowanej komórki. Gdy stan fizjologiczny gospodarza ulegnie poprawie pseudolizogenia ustaje, a cykl infekcyjny bakteriofaga zostaje wznowiony [Łoś & Węgrzyn, 2012].

Niektóre fagi wirulentne i łagodne mogą powodować infekcję chroniczną, w której w zainfekowanych komórkach wirusowe cząstki potomne są stale wytwarzane i opuszczają ją nie powodując lizy. Mechanizm ten charakterystyczny jest dla fagów nitkowatych (rodzina Inoviridae), których przedstawicielem jest bakteriofag M13 [Weinbauer, 2004].

Prawie połowa bakterii, których genomy zsekwencjonowano to lizogeny (46%) [Touchon i in., 2016], stanowiące w niektórych niszach nawet 100% populacji bakterii [Bobay i in., 2014; Fortier & Sekulovic, 2013; Labonté i in., 2019]. Profagi mogą występować zarówno w formie funkcjonalnej, jak i w formie defektywnej, zawierającej tak dużo mutacji, że nie jest możliwe dokończenie lub wręcz rozpoczęcie przez nie cyklu infekcyjnego [Bobay i in., 2014]. Mutacje te mogą dotyczyć np. genów odpowiedzialnych za wycięcie profaga z chromosomu bakteryjnego, tworzenie wirionów lub lizę komórki. Nieodłącznym zjawiskiem związanym z profagami jest konwersja lizogenna. Zjawisko to polega na zmianie właściwości fenotypowych bakterii, w których infekujący je bakteriofag łagodny wszedł w cykl lizogenny. Najważniejsze cechy nabywane drogą konwersji lizogennej wymieniono w Tabeli 3 [Brüssow i in., 2004; Cumby i in., 2012;Fortier & Sekulovic, 2013; Sebaihia i in., 2006; Schuch & Fischetti, 2009; Wang i in., 2010; Sullivan i in., 2006].

Tabela 3. Cechy nabywane na drodze konwersji lizogennej.
Mikroorganizmy niepatogenne Mikroorganizmy patogenne
  • wzrost przy niedoborze składników odżywczych
  • zdolność do zmiany profilu troficznego (przyswajanie nietypowych substratów pokarmowych)
  • tolerancja na duże zasolenie
  • usprawniony proces sporulacji
  • zwiększenie wydajności procesu fotosyntezy
  • kodowanie toksyn wydzielanych do ustroju gospodarza
  • synteza dysmutazy ponadtlenkowej (ochrona przed wolnymi rodnikami produkowanymi przez układ odpornościowy)
  • produkcja fosfolipazy
  • białka efektorowe uczestniczące w inwazji komórek gospodarza
  • formowanie biofilmów
  • tolerancja na antybiotyki
  • oporność na infekcję tym samym lub pokrewnym bakteriofagiem (na różnych etapach infekcji)
  • utrata funkcjonalności niektórych genów (na drodze dysrupcji po wintegrowaniu fagowego DNA)

Cechy wymienione w Tabeli 3, choć w istotny sposób przyczyniają się do większego przystosowania środowiskowego u bakterii nie mają istotnego znaczenia dla funkcjonowania samego bakteriofaga. Cechy warunkowane przez elementy genetyczne niemające udziału w cyklu infekcyjnym zawarte w genomach bakteriofagowych – nazywa się „moronami” (ang. more on). U niektórych profagów ich ekspresja jest niezależna od ekspresji pozostałych białek wirusowych [Juhala i in., 2000] i wówczas może zachodzić nawet przy wyciszeniu innych genów profaga ze względu na obecność własnych promotorów oraz terminatorów transkrypcji [Cymby i in., 2012; Fortier & Sekulovic, 2013]. Morony obecne w genomie fagowym mogą być przekazywane między bakteriami na drodze horyzontalnego transferu infekcyjnego [Bobay i in., 2014]. Mutacje te mogą dotyczyć np. genów odpowiedzialnych za wycięcie profaga z chromosomu bakteryjnego, tworzenie wirionów lub lizę komórki. Nieodłącznym zjawiskiem związanym z profagami jest konwersja lizogenna. Zjawisko to polega na zmianie właściwości fenotypowych bakterii, w których infekujący je bakteriofag łagodny wszedł w cykl lizogenny. Najważniejsze cechy nabywane drogą konwersji lizogennej wymieniono w Tabeli 3 [Brüssow i in., 2004; Cumby i in., 2012;Fortier & Sekulovic, 2013; Sebaihia i in., 2006; Schuch & Fischetti, 2009; Wang i in., 2010; Sullivan i in., 2006].

Tabela 3. Cechy nabywane na drodze konwersji lizogennej.
Mikroorganizmy niepatogenne Mikroorganizmy patogenne
  • wzrost przy niedoborze składników odżywczych
  • zdolność do zmiany profilu troficznego (przyswajanie nietypowych substratów pokarmowych)
  • tolerancja na duże zasolenie
  • usprawniony proces sporulacji
  • zwiększenie wydajności procesu fotosyntezy
  • kodowanie toksyn wydzielanych do ustroju gospodarza
  • synteza dysmutazy ponadtlenkowej (ochrona przed wolnymi rodnikami produkowanymi przez układ odpornościowy)
  • produkcja fosfolipazy
  • białka efektorowe uczestniczące w inwazji komórek gospodarza
  • formowanie biofilmów
  • tolerancja na antybiotyki
  • oporność na infekcję tym samym lub pokrewnym bakteriofagiem (na różnych etapach infekcji)
  • utrata funkcjonalności niektórych genów (na drodze dysrupcji po wintegrowaniu fagowego DNA)

Cechy wymienione w Tabeli 3, choć w istotny sposób przyczyniają się do większego przystosowania środowiskowego u bakterii nie mają istotnego znaczenia dla funkcjonowania samego bakteriofaga. Cechy warunkowane przez elementy genetyczne niemające udziału w cyklu infekcyjnym zawarte w genomach bakteriofagowych – nazywa się „moronami” (ang. more on). U niektórych profagów ich ekspresja jest niezależna od ekspresji pozostałych białek wirusowych [Juhala i in., 2000] i wówczas może zachodzić nawet przy wyciszeniu innych genów profaga ze względu na obecność własnych promotorów oraz terminatorów transkrypcji [Cymby i in., 2012; Fortier & Sekulovic, 2013]. Morony obecne w genomie fagowym mogą być przekazywane między bakteriami na drodze horyzontalnego transferu genów (transdukcja) lub wertykalnego transferu genów (replikacja chromosomu bakterii zawierającego profaga [Bobay i in., 2014]). Przekazywanie moronów może mieć miejsce również pomiędzy bakteriofagami na drodze rekombinacji homologicznej. Dowodem na to są wyniki analiz bioinformatycznych sekwencji moronowych identyfikowanych w genomach fagowych, które często wykazują inną zawartość par GC, co nie tylko świadczy o horyzontalnym transferze, ale sugeruje iż nie są to wydarzenia odległe ewolucyjnie [Hendrix, 2002].


Postęp w genomice wiążący się z udoskonaleniem technik sekwencjonowania klasów nukleinowych i białek (oraz spadku cen usług związanych z sekwencjonowaniem) przełożył się na powstanie ogromnych ilości danych w postaci sekwencji białkowych i nukleotydowych. Szybka analiza tych zasobów informatycznych możliwa jest tylko z użyciem komputerów oraz specjalnego oprogramowania przeznaczonego do analizy porównawczej tychże danych [Pennisi, 2011]. Dane obejmujące sekwencje nukleotydowe genów lub całych genomów oraz sekwencje aminokwasowe białek deponowane są w bazie NCBI (ang. The National Center for Biotechnology Information), będącej publicznie dostępnym repozytorium danych bioinformatycznych [Coordinators, 2017]. Wymienione w dalszych częściach Podrozdziału 1.6 programy wykorzystane na potrzeby niniejszej pracy dyplomowej są podstawowymi narzędziami do analizy bioinformatycznej wirusów, z czego niektóre (np. Virfam, Podrozdział 1.6.5) dedykowane są tylko przedstawicielom rzędu Caudovirales. Analiza genomów wirusowych wymaga specyficznej metodyki, ponieważ wiele sekwencjonowanych genomów wirusowych nie wykazuje podobieństwa do genomów innych organizmów i innych wirusów. Analogicznie wiele białkowych produktów genów wirusowych nie znajduje swoich homologów wśród produktów genów organizmów komórkowych, zaś efektem przeszukiwania bazy NCBI pod kątem sekwencji białkowych podobnych do sekwencji przewidywanych białek badanego wirusa jest długa lista dopasowań do białek wirusowych, których funkcji nie określono eksperymentalnie (ang. hypothetical protein) [Eisenstein i in., 2000]. Wyżej opisana trudność w przewidzeniu funkcji białka tylko na podstawie dopasowania do rekordów baz bioinformatycznych jest jedną z cech charakterystycznych dla genomiki i proteomiki wirusów. W ramach analiz bioinformatycznych wirusów znajdują zastosowanie programy do wyszukiwania domen funkcjonalnych, których obecność przewiduje się na podstawie motywów zawartych w badanych sekwencjach aminokwasowych (Podrozdział 1.6.4). Bywają sytuacje, w których wykrycie potencjalnej domeny funkcjonalnej nie jest tożsame z określeniem jej funkcji, co ma miejsce w przypadku rekordów oznaczanych jako „domeny o nieznanej funkcji” (ang. domain of unknown function, DUF) identyfikowanych u innych organizmów. Inną metodą przewidywania funkcji potencjalnych białek wirusowych jest wnioskowanie w oparciu o lokalizację badanego genu – białka uczestniczące w tym samym procesie kodowane są najczęściej przez geny kolinearne (tj. następujące jeden po drugim); w związku z czym, jeśli gen o nieznanej funkcji znajduje się pomiędzy dwoma o znanej funkcji, jest wówczas możliwe przewidzenie funkcji genu z dużą dozą prawdopodobieństwa (Podrozdział 1.3). Analiza genomiczna dostarcza przede wszystkim wskazówek co do dalszych kierunków badań, natomiast funkcję domniemanych białek wirusowych można zweryfikować dopiero na drodze eksperymentalnej [Eisenstein i in., 2000].

Program RAST (ang. Rapid Annotations using Subsystems Technology) wykorzystywany jest do wykrywania w sekwencji nukleotydowej potencjalnych otwartych ramek odczytu (ang. Open Reading Frame, ORF) w oparciu o występujące w zsekwencjonowanym genomie kodony START oraz kodony STOP. Program RAST umożliwia również wizualizację genomu i adnotację do rekordów z bazy NCBI [Aziz i in., 2008; Brettin i in., 2015; Overbeek i in., 2013].

Artemis jest programem funkcjonującym w oparciu o platformę Java. Dostosowany jest do użytku domowego i nie wymaga zakupu licencji na użytkowanie. Wykorzystywany jest w szczególności do adnotacji genomów prokariotycznych oraz genomów niższych eukariontów. [Rutherford i in., 2000]. Program Artemis w niniejszej pracy wykorzystano do wizualizacji sekwencji nukleotydowej zsekwencjonowanego genomu analizowanego bakteriofaga wraz z rozpoznanymi ORFami. W programie Artemis wygenerowano sekwencje aminokwasowe domniemanych produktów białkowych i zapisano w formacie FASTA. Sekwencje te poddano dalszej analizie z użyciem innych programów.

BLAST (ang. Basic Local Alignment Search Tool) jest programem, który w oparciu o algorytm Needleman’a-Wunsch’a porównuje zaimplementowaną przez użytkownika sekwencję nukleotydową lub białkową (sekwencja zapytania, ang. QUERY) z sekwencjami nukleotydowymi lub białkowymi zdeponowanymi w bazie NCBI (ang. SUBJECT). Wyniki wyszukiwania są wyświetlane w formie listy rekordów z bazy NCBI, dla których ma miejsce największe podobieństwo sekwencji nukleotydowych, jej pokrycie oraz „wartość E” (ang. e-value, expected value). Podobieństwo wyrażane jest w formie parametru SCORE (skr. S), którego wartość zależy od: przyjętej macierzy podstawieniowej (ang. substitution matrix) [Henikoff & Henikoff, 1992], od ilości kolejnych identycznych nukleotydów między sekwencją badaną a rekordem z bazy oraz od ilości kar za przerwy w ciągłości między tymi sekwencjami (karą nazywa się tu pewną wartość odejmowaną od sumy punktów przyznanych za identyczności między sekwencją badaną, a rekordem z bazy). Pokrycie jest wartością procentową, która wyraża odsetek fragmentów badanej sekwencji, dla których znaleziono przyporządkowanie do rekordu. Wartość E jest współczynnikiem zawierającym się w przedziale od 0 do 1 i wyraża prawdopodobieństwo, z jakim badana sekwencja została przyporządkowana do rekordu przez przypadek. Umownie przyjmuje się, że aby przypisanie do rekordu było istotne statystycznie, e-wartość nie może przekroczyć wartości 5 * 10-2. W wyborze odpowiedniego rekordu z listy dąży się do tego, aby wartość E była jak najmniejsza. Wartość E oblicza się według wzoru E = K*m*n*e– λ S [Altschul & Gish, 1996], gdzie:

  • K i λ są wartościami stałymi dla przyjętej macierzy podstawieniowej
  • m i n to długości sekwencji zapytania i sekwencji z bazy
  • e to liczba Eulera
  • S to wartość SCORE

Blast N (ang. Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) jest wariantem programu BLAST, który w oparciu o algorytm Needleman’a-Wunsch’a porównuje zaimplementowaną przez użytkownika sekwencję nukleotydową (QUERY) z sekwencjami nukleotydowymi zdeponowanymi w bazie NCBI. Program BLAST N wykorzystuje się do wyszukiwania sekwencji wykazujących homologię z badaną sekwencją [Altschul i in., 1990].
Blast P (ang. Protein Basic Local Alignment Search Tool) bazuje na tych samych parametrach co BLAST N, z jednym wyjątkiem – w sekwencji aminokwasowej do dyspozycji jest więcej liter (20 podstawowych aminokwasów) niż w sekwencji nukleotydowej (4 nukleotydy). Niektóre aminokwasy wykazują wzajemne podobieństwo strukturalne, w związku z czym podczas dopasowania sekwencji zapytania do rekordu z bazy przypisuje się temu podobieństwu wartość liczbową (ang. SCORE) na podstawie wybranej macierzy podstawieniowej (np. BLOSUM62) [Henikoff & Henikoff, 1992].
Blast X jest wariantem programu BLAST, służącym do dopasowywania wybranych sekwencji nukleotydowych z rekordami w bazie białek NCBI [Altschul i in., 1997; Johnson i in., 2008]. BLAST X wykorzystano w niniejszej pracy do dopasowania z rekordami bazy białek NCBI tych fragmentów sekwencji genomu badanego faga, które były homologiczne z sekwencjami genomów innych znanych fagów Serratia.

Jest to program wyszukujący ukryte modele Markowa (ang. HMMHidden Markow Models) w sekwencji aminokwasowej potencjalnego produktu białkowego, co umożliwia wykrycie potencjalnych domen funkcjonalnych [Rekapalli i in., 2009; Walters i in., 2007]. Program HMMER wykorzystano w niniejszej pracy jako narzędzie pomocnicze do wykrycia domen funkcjonalnych w potencjalnych produktach białkowych wykrytych ORF.

Virfam jest programem służącym do określania przynależności do rodziny taksonomicznej badanych bakteriofagów ogonkowych z rzędu Caudovirales. Przyporządkowanie do określonej rodziny ma miejsce w oparciu o analizę bioinformatyczną sekwencji aminokwasowych potencjalnych białek strukturalnych, które użytkownik implementuje do programu w postaci pliku FASTA. Program automatycznie wyszukuje sekwencje białek strukturalnych, które następnie wykorzystywane są jako zapytanie w globalnym dopasowaniu do rekordów bazy ACLAME (ang. A CLAssification of Mobile genetic Elements) zawierającej informacje o ruchomych elementach genetycznych, ze szczególnym uwzględnieniem plazmidów oraz bakteriofagów [Leplae i in., 2009]. Po przeszukaniu bazy program Virfam przewiduje morfotyp wirusa w oparciu o rozpoznane moduły główka-szyjka-ogonek, a następnie podaje przynależność do rodziny taksonomicznej [Lopes i in., 2014]. Jak wspomniano w Podrozdziale 1.2, kilka miesięcy temu ICTV wyodrębniło w rzędzie Caudovirales dwie nowe rodziny: Ackermannviridae i Herelleviridae; co nie jest jeszcze uwzględniane przez wiele programów bioinformatycznych, w tym Virfam. Wzięto pod uwagę w dyskusji rezultatów uzyskanych w niniejszej pracy (Rozdział 5.3.3). Wynik analizy prezentowany jest przez program Virfam w formie tzw. „drzewa przewodniego”, na którym badany bakteriofag jest umiejscawiany względem innych już scharakteryzowanych bakteriofagów ogonkowych zgodnie ze wzajemnym podobieństwem ich białek strukturalnych.

Serial Cloner (wersja 2.6.1) jest darmowym oprogramowaniem służącym do analizy sekwencji nukleotydowych, m. in: wizualizacji genomu, identyfikacji potencjalnych ORFów, tłumaczenia sekwencji nukleotydowej na sekwencję aminokwasową i symulacji cięć restrykcyjnych [Chandrakanth i in., 2010; Perez, 2004]. W niniejszej pracy program ten wykorzystano do: wyliczenia długości badanego genomu, określenia procentowego udziału nukleotydów i procentu par CG, symulacji cięć restrykcyjnych genomu badanego bakteriofaga oraz do pobierania wybranych fragmentów sekwencji genomu faga o znanych koordynatach w celu dalszych analiz z użyciem programu BLAST X.

Program ARAGORN służy do detekcji genów kodujących tRNA (ang. transfer RNA) oraz tmRNA (ang. transfer-messenger RNA) w zaimplementowanych sekwencjach nukleotydowych. Wyszukiwanie sekwencji genów kodujących tRNA odbywa się z użyciem algorytmu tRNA-CM bazującym na modelu kowariancji [Laslett & Canback, 2004]. W niniejszej pracy program ARAGORN wykorzystano do przeszukania sekwencji nukleotydowej genomu badanego bakteriofaga pod kątem obecności genów kodujących tRNA.


Podczas doświadczeń wykonywanych na potrzeby niniejszej pracy wykorzystano jako gospodarzy dwa szczepy z rodzaju Serratia sp.: OS10 i W54. Serratia to gramujemne i nieprzetrwalnikujące pałeczki z klasy Gammaproteobacteria, rodziny Enterobacteriaceae [Bender i in., 2018]. Długość komórek zawiera się w przedziale 1-5 μm [Bender i in., 2018]. Bakterie z rodzaju Serratia są względnymi tlenowcami [Bender i in., 2018]. Cechą charakterystyczną przedstawicieli rodzaju Serratia na tle pozostałych przedstawicieli rodziny Enterobacteriaceae jest zdolność do produkcji 3 enzymów: DNazy NucA, lipazy oraz żelatynazy (serralizyny) [Benedik & Strych, 1998]. Rodzaj Serratia obejmuje 15 gatunków [www.itis.gov, dostęp: 30.08.2019]:

  1. Serratia entomophila [Grimont i in., 1988],
  2. Serratia ficaria [Gill i in., 1981],
  3. Serratia fonticola [Gavini i in., 1979],
  4. Serratia glossinae [Geiger i in., 2010],
  5. Serratia grimesii [Grimont i in., 1983; Bergan i in., 1983],
  6. Serratia liquefaciens [Grimes & Hennerty, 1931],
  7. Serratia marcescens [Grimont, 2005],
  8. Serratia nematodiphila [Zhang i in., 2009],
  9. Serratia odorifera [Grimont i in., 1978b],
  10. Serratia plymuthica [Breed i in., 1948],
  11. Serratia proteamaculans [Paine & Stansfield, 1919; Grimont i in., 1978a],
  12. Serratia quinivorans [Grimont i in., 1983; Ashelford i in., 2002],
  13. Serratia rubidaea [Stapp, 1940; Ewing i in., 1973],
  14. Serratia symbiotica [Sabri i in., 2011],
  15. Serratia ureilytica [Bhadra i in., 2005],

Wielu przedstawicieli bakterii z rodzaju Serratia jest patogenami oportunistycznymi człowieka. Do infekcji człowieka bakteriami Serratia dochodzi przeważnie w szpitalach. Bakterie te zdolne są do tworzenia biofilmów, co niektórym gatunkom umożliwia kolonizację dróg oddechowych, cewki moczowej oraz przewodu pokarmowego osób dorosłych [Abdollahi i in., 2008].
Dotychczas zsekwencjonowano 20 bakteriofagów infekujących bakterie z rodzaju Serratia (Tabela 4). Dodatkowo eksperymentalnie scharakteryzowano jeszcze jednego, którego genom oszacowano (w oparciu o analizę restrykcyjną) na około 57 kb. SM701 zaliczony został do rodziny Siphoviridae i jest fagiem zjadliwym [Yu i in., 2008].

Tabela 4. Wykaz zsekwencjonowanych bakteriofagów infekujących Serratia.
Rząd Rodzina Gatunek Długość genomu Numer GeneBank Miejsce izolacji
Caudovirales Ackermannviridae KPN4 160,268 bp KX452697.1 21°08'16.8"N
79°09'24.1"E
ścieki

Bhandewadi

2050H1 159,631 bp MF285619.1 b.d.
vB_SmaA_3M 159,398 bp MH929319.1 b.d.
φMAM1 157,834 bp JX878496.1
NC_020083.1
52°14'01.3"N
0°09'11.2"E
ścieki Milton
(Cambridge, United Kingdom)
vB_Sru_IME250 154,938 bp KX147096.1
NC_042047.1
39°52'02.5"N
116°21'20.8"E
ścieki Szpital YouAn
Myoviridae BF 357,154 bp KY630187.1
NC_041917.1
Kompost z trawy
2050HW 276,025 bp MF285618.1 b.d.
Moabite 273,933 bp MK994515.1 farma trzody chlewnej
X20 172,450 bp MF036692.1 52°14'01.3"N
0°09'11.2"E
ścieki Milton
(Cambridge, United Kingdom)
χ14 171,175 bp MF036690.1
NC_041996.1
CBH8 171,175 bp MF036691.1
PS2 167,266 bp KJ025957.1
NC_024121.1
b.d.
MyoSmar 68,745 bp MN062189.1 b.d.
MTx (częściowy)
68,621 bp
MK618717.1 b.d.
Podoviridae Parlo 62,853 bp MK618715.1 b.d.
SM9-3Y 39,631 bp KX778611.3 b.d.
2050H2 39,216 bp MF285620.1 b.d.
Siphoviridae Scapp 42,969 bp MH553517.1 b.d.
Serbin 42,882 bp MK608336.1 30°38'06.5"N
96°17'52.5"W
Sadzawka
College Station,
Texas
η 42,724 bp KC460990.1
NC_021563.1
b.d.


Szczep wykorzystany w niniejszej pracy pochodzi z kolekcji szczepów wyizolowanych ze sztolni Gertruda, znajdującej się w Kopalni w Złotym Stoku (50°26'21.7"N 16°52'27.7"E). Miejscem izolacji tych bakterii był końcowy odcinek sztolni Gertruda, panują tam stabilne w skali roku warunki środowiskowe: 10,4-11,1°C temperatury powietrza i 10-12°C temperatury wody. Jest to nisza o dużym stężeniu związków arsenu: w formie arseninów (H2AsO3 ) oraz arsenianów (H2AsO4 + H+); co uniemożliwia zamieszkanie tego obszaru przez większość żywych organizmów [Drewniak i in., 2008]. Jednymi z nielicznych, obecnych tam form życia są zespoły psychrofilnych i metalotolerancyjnych mikroorganizmów, zdolnych do dysymilacyjnego oddychania arsenowego [Laverman i in., 1995; Krafft & Macy, 1998; Blum i in., 1998]. Miejsce izolacji szczepów przedstawiono na Rycinach 11 i 12. Badania wykonane w ramach niniejszej pracy prowadzone były na szczepach Serratia sp. OS10 i Serratia sp. W54 w ramach projektu badawczego „Analiza zespołu bakteriofagów infekujących bakterie zasiedlające ekstremalne środowisko zanieczyszczone metalami ciężkimi (2017/25/B/NZ8/00472)” kierowanego przez dr hab. Monikę Radlińską.

Rycina 11. Biofilmy występujące w najgłębszej dostępnej lokalizacji sztolni Gertruda w Kopalni w Złotym Stoku [Drewniak i in., 2010]: biofilmy skalne na ścianie sztolni (A, B) oraz maty mikrobiologiczne w warstwie osadów dennych (C).
Rycina 12. Mulisty biofilm, występujący tylko w wilgotnych miejscach kopalni [Cłapa i in., 2017].


Przypisy

  1. Obecnie w Europie działają dwa ośrodki wykorzystujące bakteriofagi w medycynie: Cetrum Terapii Fagowej (ang. Phage Therapy Center) w Tbilisi powstałe w 2003 roku [phagetherapycenter.com] oraz Ośrodek Terapii Fagowej przy Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu powstały w 1952 roku [iitd.pan.wroc.pl].


Tekst udostępniony jest na licencji Creative Commons Uznanie autorstwa-Na tych samych warunkach 3.0.
Dodatkowe informacje o autorach i źródle znajdują się na stronie dyskusji.