Przejdź do zawartości

Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Wyniki i dyskusja/Badanie jednego etapu replikacji (ang. One-Step Growth) faga φOS10

Dodaj linki
Z Wikibooks, biblioteki wolnych podręczników.

 Procedura zastosowana w niniejszej pracy bazowała na metodyce Kropińskiego [Kropiński, 2018] z pewnymi modyfikacjami. Modyfikacje opisano w Podrozdziale 4.19.3 Do serii badań wykorzystano szczep wrażliwy OS10. Jako optymalne wybrano odmładzanie w stosunku 1:50, trwające w zależności od stanu nocnej hodowli – od 2 do 4 godzin.

 Po przeprowadzeniu procedury opisanej w Podrozdziale 4.19.3 ustalono, że MOI wynosi 1/283 (≈0,0035), czyli daleko poniżej wartości 1,0 – dzięki czemu, w oparciu o opisany wcześniej rachunek statystyczny, przyjąć można było, iż u ponad 99,82% zainfekowanych komórek infekcja zachodziła z udziałem dokładnie 1 cząstki infekcyjnej. W związku z tym uznano, iż każda łysinka na szalce pochodziła od jednej cząstki infekcyjnej. Na Rycinie 26 przedstawiono szalki z widocznymi łysinkami, których jest odpowiednio mniej przed wysypem cząstek infekcyjnych (szalka A1) oraz odpowiednio więcej po wysypie cząstek infekcyjnych (szalka A11). Czas latencji oraz plon fagowy ustalono w oparciu o czynności opisane w Podrozdziale 4.19.3. Wyniki zebrane w Tabeli 12 zaprezentowano na poniższym wykresie (Rycina 27)

Rycina 26. Szalki z murawką bakterii Serratia sp. OS10: kontroli (K), próby badanej przed wysypem cząstek fagowych (A1) i próby badanej po wysypie cząstek fagowych (A11). Procedura według A. Kropińskiego [Kropiński, 2018, zmienione].
Tabela 12. Wyniki badania jednego etapu replikacji faga.
Numer
pomiaru 		Czas
(min) 		Ilość łysinek
(A) 		PFU/ml
(A) 		Ilość łysinek
(B) 		PFU/ml
(B)
1 6 83 830
2 21 96 960
3 36 76 760
4 51 71 710
5 66 69 690
6 81 80 800
7 86 92 920
8 91 67 670 8 800
9 96 92 920 11 1100
10 101 101 1010 7 700
11 106 97 970 31 3100
12 111 407 4070 20 2000
13 116 389 3890 22 2200
14 121 554 5540 49 4900
15 126 330 33000
16 131 270 27000
17 136 146 14600
18 141 233 23300
19 146 234 23400
20 151 125 12500
Rycina 27. Wykres zależności miana faga od czasu, zaznaczone poziomy plateau x1 i x2 oraz czas latencji TL.

Plon fagowy, czyli średnia ilość cząstek fagowych uwalniających się z jednej zainfekowanej komórki, obliczono jako stosunek miana dla górnego plateau do miana dolnego plateau (Rycina 28).

Rycina 28. Wyliczenie plonu fagowego.

 Wartość otrzymana w obliczeniach z Ryciny 15 wymagała weryfikacji, ponieważ obliczono ją w oparciu o górne plateau, które dla 2 pomiarów nie osiągnęło istotności statystycznej. W związku z tym wykonano drugie podejście, tym razem jednak zwiększając ilość pomiarów, aby przy tych samych warunkach osiągnąć stabilne górne plateau. W rezultacie uzyskano 3 niewspółliniowe wykresy: dla kolby A, kolby B i kolby C (Rycina 29).

Rycina 29. Wykres zależności plonu fagowego od czasu pomiaru.

 Jako przyczynę powstania niewspółliniowych wykresów uznać można dotychczasowe wykorzystywanie kolb B i C jako kolejnych rozcieńczeń zawartości kolby A. Jest to technika obarczona dużym błędem, ponieważ potencjalne błędy w pipetowaniu są utrwalane w następnych pomiarach. Ponieważ w żadnym z dwóch powtórzeń nie uzyskano istotnego statystycznie plateau po wysypie cząstek fagowych (ang. burst), następne 2 podejścia wykonano z wprowadzeniem modyfikacji opisanymi w Podrozdziale 4.19.3. Na każdej szalce wykonano po 2 powtórzenia z uwzględnieniem rozcieńczeń (Rycina 30). Wyniki zestawiono w formie Tabeli 13, a następnie zobrazowano w formie wykresu (Rycina 31).

Rycina 30. Szalki z murawką bakterii Serratia sp. OS10 dla: próby badanej przed wysypem cząstek fagowych (A4) i próby badanej po wysypie cząstek fagowych (A17). Procedura zmodyfikowana.
Tabela 13. Wyniki badania jednego etapu replikacji faga po modyfikacjach.
Numer
pomiaru 		Czas (min) 10 0 10 - 1 10 - 2 10 - 3
powt. średnia powt. średnia powt. średnia powt. średnia
A1 5 I: 27 26,9 I: 3 3,24 I: 0 -0,03 I: 0 0
II: 32 II: 4 II: 0 II: 0
A2 10 I: 31 31,2 I: 2 2,42 I: 1 0,49 I: 0 0
II: 33 II: 3 II: 0 II: 0
A3 15 I: 30 25,35 I: 4 3,44 I: 1 0,49 I: 0 0
II: 22 II: 3 II: 0 II: 0
A4 30 I: 23 22,65 I: 4 2,87 I: 2 0,99 I: 0 0
II: 25 II: 2 II: 0 II: 0
A5 45 I: 28 25,15 I: 3 2 I: 0 -0,01 I: 0 0
II: 25 II: 1 II: 0 II: 0
A6 60 I: 37 31,15 I: 1 2,5 I: 0 -0,01 I: 0 0
II: 28 II: 4 II: 0 II: 0
A7 75 I: 31 24,15 I: 0 1,5 I: 2 0,99 I: 0 0
II: 20 II: 3 II: 0 II: 0
A8 85 I: 31 26,65 I: 8 5,5 I: 0 -0,01 I: 0 0
II: 25 II: 3 II: 0 II: 0
A9 90 I: 34 29,65 I: 4 5 I: 0 0,49 I: 0 0
II: 28 II: 6 II: 1 II: 0
A10 95 I: 39 28,15 I: 1 1 I: 0 -0,01 I: 0 0
II: 20 II: 1 II: 0 II: 0
A11 100 I: 50 44,65 I: 4 3,5 I: 0 -0,01 I: 0 0
II: 42 II: 3 II: 0 II: 0
A12 105 I: 83 73,65 I: 40 22 I: 2 0,97 I: 0 0
II: 67 II: 4 II: 0 II: 0
A13 110 I: 45 52,15 I: 4 4,5 I: 0 -0,01 I: 0 0
II: 62 II: 5 II: 0 II: 0
A14 120 I: 113 150,15 I: 13 21 I: 0 0,49 I: 0 0
II: 190 II: 29 II: 1 II: 0
A15 130 I: 131 145,65 I: 104 85 I: 2 4,49 I: 0 0
II: 163 II: 66 II: 7 II: 0
Rycina 31. Wykres zależności plonu fagowego od czasu pomiaru.

W oparciu o uzyskane wyniki ustalono, że w wyniku infekcji jedną cząstką fagową powstaje średnio od 28 do 40 cząstek fagowych. Jest to wynik dość dokładny, odnosząc go do analogicznych badań, w których plon fagowy podaje się jako przybliżenie do wielokrotności liczby 100 [Lin i in., 2010]. Czasu latencji nie dało się dokładnie ustalić. Wiadomo jednak, że wynosi od 105 do 120 minut. Czas ten podano w formie przedziału, a nie dokładnej wartości, ze względu na kilka okoliczności:

  1. Wysyp cząstek fagowych niejednokrotnie rozpoczynał się w różnych momentach dla różnych rozcieńczeń w ramach tej samej próby biologicznej.
  2. Przy zachowaniu tych samych warunków eksperymentu komórki mogły cechować się innym stanem fizjologicznym, co wpływa na szybkość cyklu infekcyjnego.
  3. Warunki prowadzenia eksperymentu umożliwiały pobór prób z niemniejszą częstotliwością niż jeden pobór co 5 minut.

Wynik cechuje się podobną (lub też niewiele większą) dokładnością względem analogicznych badań uzyskanych dla innych bakteriofagów [Daugelavičius i in., 2007]. Badanie przeprowadzone według zmodyfikowanej procedury odbyło się w jednym powtórzeniu. W związku z tym, dla większego uwiarygodnienia wyników należałoby wykonać kolejne powtórzenia tej procedury.



Tekst udostępniony jest na licencji Creative Commons Uznanie autorstwa-Na tych samych warunkach 3.0.
Dodatkowe informacje o autorach i źródle znajdują się na stronie dyskusji.
Źródło: „https://pl.wikibooks.org/w/index.php?title=Wstępna_charakterystyka_bakteriofaga_Serratia_φOS10/Wyniki_i_dyskusja/Badanie_jednego_etapu_replikacji_(ang._One-Step_Growth)_faga_φOS10&oldid=448979”