Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Materiały

3. Materiały

3.1 Próbka badana

• Zawiesina cząstek fagowych, wyizolowanych z biofilmu pozyskanego ze sztolni Gertruda z nieczynnej kopalni w Złotym Stoku [Radlińska, dane nieopublikowane].

3.2 Szczepy bakteryjne

• Escherichia coli Top10F’: F′ [lacI^q, Tn10(Tet^R)] mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Str^R) endA1 nupG
• szczepy Serratia spp. OS10 oraz W54 (kolekcja Pracowni Analizy Skażeń Środowiska Uniwersytetu Warszawskiego)

3.3 DNA

3.3.1 Startery do reakcji PCR

Tabela 5. Wykaz starterów wykorzystywanych w reakcjach PCR przeprowadzanych w niniejszej pracy. Małymi literami zaznaczono sekwencje dodane, niewystępujące w genomie faga, które zawierają miejsce restrykcyjne umożliwiające klonowanie amplifikowanego DNA.

Nazwa startera Sekwencja startera Długość (nt) mOS10f gttgttcatATGGCCTATCAACTTATCTATGC 32 mOS10r gttgttctcgagGTAGTTCTCTTGCTGTGCTAC 33 cosOS10f CACCGTGCTCGTATACGTAC 20 cosOS10r GTTACCTGACTTGTTACCCGAG 22

3.3.2 Wykorzystany wektor plazmidowy

• pUC19: Amp^R; ori pMB1, lacZ; MCS; 2,7kpz [ThermoScientific]

3.3.3 Marker wielkości

• wzorzec wielkości fragmentów DNA GeneRuler™ DNA Ladder Mix 100-10000 bp [ThermoScientific]

3.4 Podłoża bakteryjne

• podłoże płynne LB (ang. Lysogeny Broth): 20 g LB Difco Broth na 1000ml H₂O [Bacton]
• podłoże półpłynne LB: płynne podłoże LB zestalone agarem do końcowego stężenia 0,7%
• podłoże stałe LB: płynne podłoże LB zestalone agarem do końcowego stężenia 1,5%

Uzupełnienie podłóż:

• ampicylina: roztwór 100 mg/ml (w/v) – stężenie końcowe 150 µg/ml
• IPTG: roztwór 1 M – stężenie końcowe 0,5 mM
• X-gal: roztwór 40 mg/ml – stężenie końcowe 40 µg/ml

3.5 Bufory i roztwory

3.5.1 Bufory i odczynniki do elektroforezy DNA

• bufor TBE: 1,35 M Tris; 0,45 M kwas borowy; 25 mM EDTA (5x stężony)
• roztwór bromku etydyny (stężenie 10 mg/ml) do uwidocznienia DNA w żelach agarozowych
• roztwór obciążnikowy: 0,25% błękit bromofenolowy; 30% glicerol
• żel agarozowy (0,8%): agaroza 0,8 g/100 ml (w/v) w 1x stężonym TBE

3.5.2 Bufor SM

• 100 mM NaCl; 10 mM MgSO4; 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)

3.5.3 Bufory do przygotowywania komórek kompetentnych metodą rubidowo-wapniową

• bufor TFB I: 100 mM RbCl, 50 mM MnCl, 30 mM octan potasu, 10 mM CaCl₂, 15% glicerol, pH 5,8 ustalone przy użyciu rozcieńczonego kwasu octowego
• bufor TFB II: 10 mM MOPS, 75 mM CaCl₂, 10 mM RbCl, 15% glicerol, pH 6,8 ustalone przy użyciu NaOH

3.5.4 Bufor STE

• 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0,1 M NaCl

3.6 Enzymy

• 10 mg/ml DNaza (wodny roztwór) [Sigma-Aldrich]
• 10 mg/ml RNaza (wodny roztwór) [Panreac AppleChem]
• endonukleazy restrykcyjne, w buforach wskazanych przez producenta [ThermoScientific]
• Fragment Klenowa polimerazy I [ThermoScientific]
• ligaza faga T4, w odpowiednim buforze do ligacji wskazanym przez producenta [ThermoScientific]
• polimeraza DNA faga T4 [ThermoScientific]
• polimeraza DNA Phusion [ThermoScientific] wraz z odpowiednim buforem (High Fidelity Buffer 10x) wskazanym przez producenta
• proteinaza K [A&A Biotechnology]

3.7 Inne

• 10 mM ATP
• 10 mM dNTP mix [ThermoScientific]
• CaCl₂, 1 M roztwór wodny (do końcowego stężenia 2 mM)
• chloroform [Poch]
• etanol 70% [Poch]
• izopropanol [Poch]
• jałowa woda
• mieszanina fenol-chloroform 1:1 [Carl Roth]
• NaCl [Poch]
• SDS, roztwór 10% [Poch]
• Tris-HCl roztwór (pH 7,5)
• wodny roztwór glikolu polietylenowego (PEG4000 10x) 50% (w/v) [Carl Roth]

3.8 Zestawy

• zestaw do izolacji plazmidowego DNA Plazmid Miniprep AX [A&A Biotechnology]
• zestaw do oczyszczania po reakcji PCR Clean-up [A&A Biotechnology]
• zestaw do reizolacji z żelu agarozowego Gel-out [A&A Biotechnology]

3.9 Aparatura

• aparat do zdjęć z lampą UV GeneSYS
• aparat poziomy do elektroforezy w żelach agarozowych [Sigma]
• Eppendorf Centrifuge 5415D
• Eppendorf Centrifuge 5415R
• Eppendorf Centrifuge 5804R
• łaźnia wodna z termostatem
• spektrofotometr NanoDrop [ThermoScientific]
• spektrofotometr UVmini-1240 [Shimadzu]
• termocykler [BioRad]
• termomixer compact [Eppendorf]
• wytrząsarka

3.10 Oprogramowanie

• ARAGORN (Podrozdział 1.6.7) [Laslett & Canback, 2004]
• Artemis (Podrozdział 1.6.2) [Rutherford i in., 2000]
• Blast N (Podrozdział 1.6.3) [Altschul i in., 1990]
• Blast P (Podrozdział 1.6.3) [Henikoff & Henikoff, 1992]
• Blast X (Podrozdział 1.6.3) [Altschul i in., 1997; Johnson i in., 2008]
• HMMER (Podrozdział 1.6.4) [Rekapalli i in., 2009; Walters i in., 2007]
• Libre Office Calc
• Libre Office Writer
• Microsoft Word 2007 (licencja nr M682C-7HJCP-MQTV7-FQ242-6X9XM)
• RAST (Podrozdział 1.6.1) [Aziz i in., 2008; Brettin i in., 2015; Overbeek i in., 2014]
• Serial Cloner (Podrozdział 1.6.6) [Chandrakanth i in., 2010; Perez, 2004]
• Virfam (Podrozdział 1.6.5) [Lopes i in., 2014]